LTB-hpaA融合基因原核表达产物的鉴定及其免疫保护作用

摘要

幽门螺杆菌是微需氧的革兰阴性杆菌，呈螺旋状。多数国家和地区Hp感染率高达50％以上，许多感染者都是无症状的，但是有部分感染者可出现急慢性胃炎和消化性溃疡，Hp的持续性感染还与胃腺癌和胃淋巴瘤的发生密切相关。目前关于Hp疫苗的研究较少。 Hp粘附素是细菌鞭毛鞘膜蛋白，也是细菌主要的粘附因子之一。hpaA基因位于细菌基因组DNA上，其核苷酸或氨基酸序列高度保守，并且有研究发现在大约86％的Hp患者血清中可检测到HpaA抗体，因此可作为Hp基因工程疫苗的侯选抗原。 基因工程疫苗多以单一蛋白作为抗原，其免疫效果常不尽人意，通常需要使用佐剂来提高此类疫苗的免疫效果，有文献报道LTB粘膜免疫佐剂活性明显高于CTB，因此LTB作为疫苗佐剂更为合适。 材料方法： 1.菌株来源及培养 将本室保存的HpY06、SS1(sydneystrain1)菌株涂布于Hp选择性平板培养基上，微需氧环境37℃培养5d，凡能在Hp选择性培养基上生长、针尖样透明菌落、革兰阴性细小弯曲杆菌、快速尿素酶试验阳性、氧化酶试验阳性、能与Hp全菌抗体发生凝集者鉴定为Hp。 大肠杆菌44815株购自中国药品生物制品检定所。将大肠杆菌44815株接种于LB琼脂平板上，37℃培养24h。挑取单个菌落进行革兰染色镜检，若是革兰阴性、中等大小杆菌者，再次转种培养。 2.细菌基因组DNA的制备 采用常规的苯酚—氯仿法提取HpY06株和大肠杆菌44815株培养物的基因组DNA，经无DNA酶的RNA酶消化后，再用苯酚—氯仿法将提取的DNA溶于TE缓冲液中作为PCR的模板，用分光光度法测定DNA的浓度和纯度。 3.hpaA基因和ltB基因的扩增 根据报道的hpaA和ltB的基因序列设计引物，采用PCR扩增hpaA和ltB全基因序列，溴乙锭染色的1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 4.hpaA和ltB基因T-A克隆和核苷酸序列测定 采用上海申能博彩生物科技有限公司(SNBC)的3SPCRProductPurificationKitV2.0回收目的扩增片段。目的扩增片段连接于pUCm-T载体中，形成用于测序的pUCm-T-hpaA、pUCm-T-ltB重组质粒。转化至E.coliDH5α中，经蓝白筛选的阳性克隆扩增后用碱变性法提取重组质粒，双酶切鉴定后用双脱氧链末端终止法测定插入片段的核苷酸序列。所获得的序列与GeneBank登录的hpaA基因和ltB基因序列进行核苷酸同源性比较。 5.ltB-hpaA融合基因的构建 扩增含pUCm-T-ltB和pUCm-T-hpaA的E.coliDH5α，碱变性法提取质粒，经无DNA酶的RNA酶消化后，再用苯酚-氯仿法提取质粒。以pUCm-T-ltB质粒为模板，PCR扩增ltB全基因片段，ltB上游引物序列：5'-CCGGGATCCTGAATAAAGTAAATGTTA-3’(BamHⅠ)下游连接引物序列：5，-CTTTAAAATGATTATTTGCTCTGTTTTCCATACTGATTGCCGC-3’，反应条件同上，采用凝胶回收试剂盒(BBST)回收目的片段。pUCm-T-hpaA质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ37℃双酶切2h，回收目的片段，紫外分光光度法测定其浓度。以总含量100ng、ltB∶hpaA≈2∶1两种DNA回收片段为模板，反应总体积为90μl，内含除引物外的PCR各试剂，反应参数：94℃5min，×1；94℃30sec，45℃30sec，72℃150sec，×10；72℃10min，×1，以便形成复合模板。然后加入浓度均为250nmol/L的上述ltB上游引物和hpaA下游引物5'-CCGAAGCTTTCGGTTTCTCTTGTTTTTC-3’(HindⅢ)，反应参数：94℃3min，×1；94℃30S，50℃30S，72℃90S，×10；94℃30S，50℃30S，72℃180S(以后每循环增加15S)，×15；72℃10min，×1。1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，目的扩增产物的预期大小为1177bp。 6.ltB-hpaA融合基因T-A克隆、亚克隆和核苷酸序列测定 按上法将ltB-hpaA片段克隆、转化、扩增、提取质粒。测序对比序列后，将重组质粒及pQE32双酶切后获得的目的片段进行连接，转化于E.coliM15，获得工程菌pQE32-ltB-hpaA-M15。然后扩增、提取质粒后再次测序。 7.目的重组蛋白表达和纯化 重组表达系统pQE32-ltB-hpaA-M15分别在含1.0、0.5和0.1mmol/LIPTG的LB培养基中37℃震荡培养，其中1.0mmol/LIPTG诱导产物经超声波破碎、5000r/min离心5min后分为上清和沉淀，采用SDS-PAGE检查重组蛋白(rLTB-HpaA)的分子量、表达产量和存在形式。采用Ni-NTA亲和层析法提纯上述重组蛋白。 8.rLTB-hpaA免疫原性、免疫反应性和佐剂活性的鉴定 以兔抗Hp全菌抗体为一抗、HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，用westernbolt检测rLTB-HpaA的免疫反应性。NTA亲和层析法(BBST)收集的rLTB-HpaA免疫家兔，用westernbolt检测rLTB-HpaA的抗原性。 用牛GM1(Sigma)包被酶标板，洗涤后分别加入每孔4μg的rLTB-HpaA，重复4孔。以兔抗rLTB-HpaA血清为一抗、HRP标记羊抗兔IgG为二抗、OPT为底物，显色后检测OD490吸光值。实验中以等量BSA代替rLTB-HpaA作为阴性对照。以阴性对照平均吸光值+3SD为阳性。 9.小鼠保护试验 将BALB/c小鼠分组，每组12只。各组分别命名为实验组(rHpaA)、实验组(rLTB-HpaA)、感染对照组和正常对照组。将rHpaA和rLTB-HpaA分别溶于pH7.4、0.01mol/LPBS中。各试验组小鼠分别用rHpaA、rLTB-HpaA进行口服(灌喂)免疫，末次免疫后第28、30、32d三次灌喂5×1010CFU/ml的HpSS1株悬液200μl。末次感染4周后处死各组小鼠，取胃窦组织标本匀浆后接种于选择性哥伦比亚血琼脂平板，微需氧条件下37℃培养5-7d，Hp鉴定方法同前。10.ELISA 用浓度为20μg/mlrLTB-HpaA融合蛋白包被酶标板，分别以1∶200稀释的患者血清为一抗、HRP标记的羊抗人IgG为二抗、邻苯二胺为底物，用ELISA来检测126例Hp感染者血清中HpaA抗体存在情况。显色后用酶联免疫检测仪检测490nm的吸光值，超过6份阴性血清平均吸光值+3SD者为阳性。 结果1.PCR ltB、hpaA、ltB-hpaA的PCR扩增片段的大小分别约为375bp、802bp和1177bp。 2.核苷酸和氨基酸序列分析 与GenBank登录的基因序列比较，所克隆的hpaA和ltB核苷酸序列相似性分别为94.25％～97.32％和99.12％～99.71％，氨基酸序列相似性为95.38％～98.46％和97.58％～99.19％。ltB-hpaA融合基因序列与ltB、hpaA基因序列完全相同。 3.表达载体的鉴定 pQE32-ltB-hpaA经双酶切和琼脂糖凝胶电泳后，在预期位置上可见目的条带；核苷酸序列测定结果证实了插入的目的基因序列和方向正确。 4.目的：蛋白的表达 SDS-PAGE结果表明，IPTG能较好地诱导目的蛋白rLTB-HpaA的表达，产量约占全菌蛋白的30％，但主要以包涵体形式存在。 5.rLTB-hpaA的免疫原性、免疫反应性和佐剂活性。 Westernbolt证实：兔抗Hp全菌抗体和NTA亲和层析法收集的rLTB-HpaA免疫家兔后产生的抗体均能与rLTB-HpaA结合。 anti-rLTB-HpaA血清1∶10、1∶20、1∶40、1∶80稀释度时，rLTB-HpaA阳性判断标准值分别为0.68、0.52、0.55和0.19，rLTB-HpaA试验组OD490值分别为1.64、1.55、1.52、1.10，表明rLTB-HpaA能与牛GM1结合。 6.小鼠保护试验 rHpaA免疫小鼠的保护率仅为66.7％，而rLTB-HpaA免疫小鼠的保护率可增至83.3％。 7.ELISA结果 6例阴性血清的OD490均值±SD为0.11±0.03，阳性标准为0.20；81.6％患者血清(102/125)HpaA抗体检测结果阳性，其OD490值范围0.54～1.84。 6例细菌阴性对照的OD490均值±SD为0.04±0.04，阳性标准为0.16；41株Hp的HpaA检测结果均阳性，其OD490值范围0.52～1.47。 结论：1.本研究成功地构建了ltB-hpaA融合基因高效原核表达系统。 2.表达的rLTB-HpaA有良好的免疫原性和佐剂活性，并对Hp感染小鼠有较强的免疫保护作用。

目录

前言

第一部分 大肠杆菌44815株和幽门螺杆菌的分离培养

第二部分 大肠杆菌44815株和幽门螺杆菌基因组DNA的提取

第三部分 聚合酶链聚合反应扩增1tB和hpaA基因

第四部分 TA克隆和测序

第五部分 聚合酶链聚合反应扩增1tB-hpaA融合基因

第六部分 TA克隆和测定

第七部分 原核表达载体的构建

第八部分：融合蛋白的表达与纯化

第九部分 融合蛋白免疫原性和免疫反应性的鉴定

第十部分 融合蛋白佐剂活性的鉴定（GM1-ELISA）

第十一部分 小鼠保护实验

第十二部分 ELISA

讨论

参考文献

幽门螺杆菌的致病因子的研究

致谢