Wnt通路相关基因多态性与胃癌发病风险的病例对照研究

摘要

[目的]变性高效液相色谱(DHPLC)技术在1996年被首次应用于基因突变的筛查，随后，这种技术以其灵敏、高效等优点被广泛接受并用于基础研究和临床疾病诊断。随着DHPLC功能不断地开发和拓展，此项技术除了被用于基本的基因突变的检测外还被应用于DNA微卫星鉴定、肿瘤杂合性缺失的检测、RF-PCR的竞争性定量、人种遗传学分析、基因作图、核酸中自身剪切反应的研究、DNA片段大小测定、寡核苷酸的质量控制和纯化、线粒体DNA分析、CpG岛甲基化的分析等涉及基因组研究的多领域。DHPLC技术在国外已经应用的较为广泛，不仅用于实验室也用在临床；在国内该技术的应用虽然也有报道，但是总体来说还是起始阶段，并且仅限于实验室研究。 作为第三代分子遗传标记的单核苷酸多态性(SNP)，是人类可遗传的变异中最常见的一种，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。与第一代、第二代遗传标记相比，SNP具有高密度、稳定和易于分型等优势，因而在疾病特别是多基因疾病研究领域显示了巨大的优势。SNP已经被用于研究个体间差异，虽然大多数SNPs是“沉默”的，但至少一部分表现出与疾病发生发展和严重程度相关。 在胚胎发育、肿瘤发生等关键的生理病理过程中都扮演重要角色的Wnt通路是被研究的最多的信号传导通路之一。研究已经发现Wnt通路组件的不恰当激活参与了多种人类肿瘤的发病过程。 胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其分子生物学机制十分复杂，其中遗传改变包括癌基因、抑癌基因和肿瘤易感基因的异常等。关于胃癌易感基因的研究已经比较广泛而且深入，这其中有报道发现某些位于基因外显子等区域的单核苷酸多态性与胃癌的发生、发展相关，但是Wnt通路相关成员编码基因的SNPs与胃癌的发病风险是否具有相关性还未见报道。鉴于以上所述，本研究拟通过DHPLC技术分析临床患者基因组Wnt通路成员糖原合成酶激酶3β(glycogensynthasekinase3β，GSK-3β)基因rs3755557位点、β连环蛋白(β-catenin)基因rs1880481和rs3864004位点、结肠腺瘤性息肉病基因蛋白(adenomatouspolyposiscoli,APC)基因rs3777860位点的基因型、基因频率，以探讨该通路基因SNPs与胃癌发病的相关性。 [方法]按照实验设计，将病例分为两组——对照组(胃炎组)包括61例胃炎患者，和胃癌组包括26例胃癌患者。实验过程依次如下：通过常规酚法提取患者静脉血标本的基因组DNA设计四对引物扩增目的DNA片断，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的特异性，经测序对PCR产物进行确认；PCR产物在PCR仪内经变性-退火的循环过程以形成同源及异源双链分子混合物，然后进行DHPLC检测结合测序分析基因型。DHPLC检测的过程如下：在相应的样品中分别任选一个峰形为纯合峰的样品及一个杂合峰样品(杂合子)进行双向测序，以确认其基因型。然后将纯合峰样品与其它纯合峰样品混合，再次如前述方法杂交后进行DHPLC检测。若仍为纯合峰，说明未知样品基因型与该样本相同，为同种纯合子；若为杂合峰，说明该样本基因型与该样本不同，为另一种纯合子。 [结果]通过本实验，得到了以下结果：(1)对于rs3755557位点、rs1880481位点和rs3777860位点，DHPLC检测结果显示双峰或单峰，分别对应杂合峰和纯合峰，可以清楚区分；测序的结果与DHPLC检测结果相一致。(2)统计学分析未发现rs3755557位点和rs3777860位点基因型及等位基因频率在胃癌组与对照组间有统计学意义。(3)rs1880481位点等位基因频率在各胃癌组与相应对照组间没有统计学差异。该位点杂合基因型在男性对照组的频率(59.52％)显著高于男性胃癌组(26.67％)，OR=0.247,CI为0.067～0.907(P=0.038)。(4)没有得到rs3864004位点理想的检测结果。 [结论](1)GSK-3β基因rs3755557位点、APC基因rs3777860位点基因型及等位基因不增加胃癌发病风险；(2)β-catenin基因rs1880481位点杂合基因型低下可导致男性胃癌风险性增加；(3)DHPLC技术结合测序可以较快速、准确的检测目的SNP位点。

目录

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

(附表一) 病例资料

变性高效液相色谱技术应用进展

Axin研究进展

学习期间参加课题与发表论文情况

致谢