Toll样受体4在大鼠、小鼠急性肺损伤时的表达及蓝桉油和糖皮质激素对大鼠Toll样受体4表达的影响

摘要

本文研究目的：建立大鼠小剂量脂多糖(LPS)气管内滴注和小鼠鼻腔内给药致急性肺损伤的模型。检测大鼠和小鼠支气管肺泡灌洗液中白细胞总数的变化，通过病理切片HE染色观察肺部病理变化，并通过免疫组织化学检测气道内TLR4的表达。用泼尼松和不同剂量组的蓝桉油短期治疗大鼠急性肺损伤，来观察蓝桉油和糖皮质激素对肺部急性炎症和TLR4表达的影响，并通过Western-blot来观察糖皮质激素和蓝桉油对炎症反应中重要因子-NF-κB的影响。 研究方法：分别以SD大鼠和ICR小鼠为研究对象。大鼠气管内给予脂多糖(LPS)，小鼠鼻腔给予LPS建立急性肺损伤模型。 (1)大鼠进行右侧支气管肺泡灌洗，灌洗液(BALF)收集后1小时内取0.2ml，用白细胞计数液倍比稀释后进行白细胞计数。小鼠气管插管进行双侧支气管肺泡灌洗，灌洗液离心后沉淀重悬，用白细胞计数液倍比稀释，计数。 (2)取未灌洗的气管、支气管和肺组织，经10％甲醛溶液中固定，漂洗、脱水、透明和石蜡包埋。切片常规化蜡、梯度酒精下行入水，行HE染色。按照本室制定的分级标准进行分析。 (3)石蜡切片，常规脱蜡至水，Envision二步法做免疫组织化学染色。采用图像分析系统测定气管和细支气管上皮阳性染色的平均光密度。 (4)提取大鼠肺组织细胞核蛋白，用免疫印迹电泳方法观测细胞核内NF-κB/p65的表达情况。 (5)大鼠气管内滴注LPS后，分别用泼尼松和不同剂量的蓝桉油短期治疗。然后检测BALF中的白细胞总数、肺组织病理、TLR4的表达和肺组织细胞核蛋白的表达。 (6)计量资料以x±s表示，采用两组间均数t检验和q检验；等级资料采用u检验。P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有非常显著性差异。 研究结果： 1.大鼠急性肺损伤模型LPS(2mg·kg-1)连续两天气管内给药，造模周期72h，可成功复制大鼠急性肺损伤模型。BALF中白细胞计数结果示模型组白细胞计数明显高于正常组，病理结果显示模型组肺部炎症明显。 2.大鼠气道TLR4的表达正常大鼠气道上皮细胞内可见TLR4的少量表达，且各部位TLR4分布无差异。LPS刺激后，主支气管和肺内细支气管上皮细胞内TLR4的表达显著高于正常对照组。各部位间比较发现，肺内细支气管上皮细胞内的表达高于气管和主支气管。 3.小鼠急性肺部炎症模型6mg·ml-1浓度的LPS溶液，根据体重以10mg·kg-1剂量鼻腔内给药可成功复制小鼠急性肺部炎症模型。模型组小鼠BALF中白细胞总数较正常组显著性增高。HE染色显示肺部炎症明显重于正常对照组。 4.小鼠气道TLR4的表达正常小鼠气道上皮细胞有较弱TLR4的表达。TLR4的在各部位分布不均匀，支气管上皮内表达较高。LPS刺激可使气道内TLR4的表达升高，气管上皮内TLR4升高最明显。 5.蓝桉油的作用蓝桉油治疗后BALF中白细胞总数较模型组有显著降低，肺组织病理显示肺部炎症减轻。肺内细支气管上皮细胞内TLR4表达的吸光度值与模型组比显著降低。蓝桉油未能抑制NF-κB/p65表达的升高。 6.治疗剂量糖皮质激素的作用治疗剂量的泼尼松可减轻大鼠肺部的炎症反应。BALF中白细胞计数明显少于模型组。肺病理炎症也较模型组为轻。泼尼松可降低气道内TLR4的表达，尤其是支气管和肺内细支气管内的表达。并且泼尼松可抑制肺组织细胞内NF-κB/p65的表达。 研究结论： 1.LPS(细菌内毒素)局部给予(大鼠气管滴注和小鼠鼻滴)可致明显的急性肺部炎症模型； 2.正常大鼠和小鼠气道上皮细胞可表达TLR4，大鼠气道各部位TLR4表达无明显差异，小鼠气道内TLR4的分布不均匀，支气管上皮细胞内表达较高；在LPS刺激引起的急性肺部炎症反应时，气道上皮细胞TLR4表达增高，说明LPS可激活TLR4受体信号转导途径； 3.LPS(2mg·kg-1)气管内滴入，连续两天，可以诱导产生大鼠急性肺部炎症反应；蓝桉油对LPS引起的BALF中白细胞浸润和肺组织中炎症反应有抑制作用，并可抑制由LPS刺激引起的TLR4的表达增高； 4.在LPS引起的大鼠气道上皮细胞TLR4表达增高的同时，肺组织内NF-κB/p65的表达也升高。说明LPS可通过TLR4信号转导途径使NF-κB/p65活化。蓝桉油短期用药(3天)未能抑制肺组织内NF-κB/p65的表达升高。

目录

摘要

引言

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

5.结论

参考文献

脂多糖、Toll样受体与急性肺损伤

完成论文和成果

致谢