一株产苯丙氨酸脱氢酶菌株的分离鉴定、产酶条件及其酶特性的研究

摘要

苯丙氨酸脱氢酶(Phenylalaninedehydrogenase，EC1.4.1.20，简称PheDH)是临床苯丙酮尿症的检测用酶。国外已有检测苯丙酮尿症的酶试剂盒出售，国内目前尚无该酶产品。 本研究从土壤中分离筛选到一株产苯丙氨酸脱氢酶的菌株X5-3，对其进行鉴定，并进一步研究了该菌株的产酶发酵条件、酶的初步纯化及该酶的性质。主要试验结果如下： 1.产酶菌株的分离、筛选和鉴定经过以苯丙氨酸为主要碳氮源的培养基的富集、纯化后，得到5株菌，通过酶活性测定，确定菌株X5-3为本研究的最佳产酶菌株。通过对该菌株的形态学、生理生化特性鉴定，G+Cmol％含量测定，16SrDNA测序和系统发育分析，确定菌株X5-3属于无色杆菌(Achromobactersp.)。 2.菌株产酶发酵条件的优化对发酵产酶的各个条件，采用摇瓶震荡培养，以测定酶活为主要指标，确定了该菌株发酵产酶的最佳培养基组成为：谷氨酸钠，18.0g；葡萄糖，18.0g；L-Phe，5.0g；NaCl，2.0g；K2HPO4·3H2O，2.0g；KH2PO4，2.0g；MgSO4·7H2O，0.1g；酵母膏，0.1g；水，1000ml；pH7.0。最适培养条件为：培养温度30℃，装液量为100ml三角瓶装25ml培养基，于150rpm转速下培养48h。在上述培养条件下发酵，发酵液的酶活可达0.25U/ml。 3.酶的纯化和性质在最佳培养条件下培养，收集的细胞经高压破碎后制成粗酶液，再经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharoese离子交换层析、ToyopearlHW-65C疏水层析、SephadexG-100分子筛层析后，提纯了约268倍，比活达到12.04U/mg。根据凝胶层析G-100粗略估计出该苯丙氨酸脱氢酶的分子量在150,000Da左右，纯化后的酶经SDS-PAGE检测，显示为三条带，其分子量分别为66,200Da、55,000Da和43,000Da。这三条带是否都是该苯丙氨酸脱氢酶的亚基还需要进一步实验来证明。对苯丙氨酸脱氢酶的理化性质进行了研究，结果表明：酶反应的最适pH为7.5，其最适作用温度为40℃；在pH6.0～8.0，45℃以下稳定。Ag+、Fe2+、pb2+和Zn2+对酶活有较强的抑制作用；Cu2+、Fe3+、po2+和Ni+对酶有很强的抑制性，使酶活基本丧失；化合物NaN3、螯合剂EDTA和表面活性剂Tween20、Tween80、TritonX-100对酶活基本没有影响；邻菲罗啉对酶有较强的抑制作用，SDS对酶活也有很强抑制作用。

目录

文摘

英文文摘

第一章文献综述

第二章产苯丙氨酸脱氢酶菌株的分离与鉴定

第三章菌株X5-3产酶的发酵条件研究

第四章苯丙氨酸脱氢酶的初步纯化与性质研究

第五章结论与展望

参考文献

硕士学习期间文章和获奖情况

致谢