鲍（Haliotis diversicolor supertexta）核转录因子Ab-Rel的功能与特性分析及分子检测方法的建立

摘要

Rel/NF-κB是一族重要的转录因子蛋白，其参与调控免疫细胞活化、胚胎发育、应激反应、细胞增殖和凋亡等多种细胞生理活动。研究表明NF-κB过度活化与炎症、肿瘤、病毒感染等免疫及病理过程有非常密切的关系。在高等哺乳动物，Rel/NF-κB作为免疫信号传导因子得到了较深入的研究。新药研发领域中，NF-κB信号通路也已成为了重要的靶点。本论文包括基础理论研究和新应用技术研究两部分。在基础理论研究方面，最主要创新性成果是(Ⅰ)在国际上第一次克隆了腹足动物九孔鲍H diversicolor supertexta核转录因子(Ab-Rel)基因，测定了该基因的全长cDNA核苷酸序列，确定了Ab-Rel与同源蛋白的分子进化关系；(Ⅱ)对Ab-Rel两个不同功能区进行了重组表达、蛋白纯化、功能分析与抗体制备，通过试验证明了Ab-Rel与Rel/NF-κB蛋白家族在功能上的相似性，确定了贝类NF-κB蛋白的分子结构模式；(Ⅲ)对Ab-Rel进行了转录表达、蛋白活性等功能分析，揭示了贝类NF-κB在免疫反应中的激活机理，用实验证明了NF-κB信号通路在贝类中的功能保守性：(Ⅳ)利用杆状病毒．昆虫细胞表达系统表达了鲍核转录因子蛋白，对Ab-Rel在昆虫细胞中进行了亚细胞定位，并对其核定位信号进行了功能鉴定。所有试验结果为低等无脊椎动物天然免疫防御系统的研究以及探索NF-κB信号通路的进化起源提供了基础。在新应用技术研究方面，建立了(Ⅰ)双抗体间接ELISA和(Ⅱ)磁捕获等分离检测NF-κB蛋白的新技术。双抗体间接ELISA技术是利用两个分别针对Rel蛋白不同分子结构域的抗体，对体内NF-κB蛋白进行检测，该技术要比普通的ELISA灵敏，更适用于检测表达量较低，如转录因子之类的蛋白。我们建立的用于分离NF-κB蛋白的磁捕获技术是以磁珠-DNA-蛋白质亲和为基础的分离技术，因为只有具有活性的NF-κB才能被磁珠捕获，所以该技术不仅能用于分离NF-κB，同时还能对其活性进行检测。磁捕获NF-κB技术操作简单，样品受外力影响小，为研究蛋白互作以及药物筛选提供了一条新的途径。 主要结果包括下列部分： 1．鲍核转录因子全长cDNA的克隆与序列分析 根据Rel蛋白的结构特征设计了寡聚核苷酸引物，利用3′，5′cDNA未端快速扩增技术(3′，5′RACE)获得了鲍核转录因子(Ab-Rel)的全长cDNA序列。该cDNA全长1943bp，具有一个1752 bp的开放读码框，编码大小为584个氨基酸的蛋白。对Ab-Rel核酸和氨基酸序列进行生物信息学分析，并构建了系统进化树。结果表明，鲍核转录因子Ab-Rel具有Rel蛋白家族的主要特征，如DNA结合基序RGLRFRYECE，核定位信号(nuclear localization signal，NLS)EEKRKR和位于NLS上游25个氨基酸的磷酸化位点RRPS。在以邻近法构建的系统进化树中，Ab-Rel与昆虫Dorsal类Rel蛋白分在同一个亚群中，并都归属于羧基端具有转录激活域(TD)的Rel蛋白家族。 2．Ab-Rel的原核表达，蛋白活性分析与鲍NF-κB晰结构的鉴定 根据Ab-Rel特殊的蛋白结构分别构建了九孔鲍Ab-Rel的Rel同源区(RHD)和转录激活区(TD)的原核表达载体，在大肠杆菌中进行高效表达和纯化，并制备了对Ab-Rel RHD和TD特异的两个多克隆抗体。EMSA结果表明重组Ab-Rel RHD蛋白具有特异的DNA结合能力，从蛋白功能上证实了Ab-Rel与其它Rel家族成员的相似性。以获得的两个抗体进行Western印迹分析了鲍NF-κB蛋白的分子结构，证实了Ab-Rel是鲍NF-κB蛋白的一个大亚基，进而从分子结构上验证了NF-κB蛋白在腹足动物．鲍与高等动物之间的相似性。 3．Ab-Rel的表达分析 通过半定量RT-PCR．和Norther杂交试验检测不同组织中Ab-Rel mRNA的含量发现，Ab-Rel在所检测的组织中均有表达，表现了其功能的多样性。但在血淋巴细胞中．Ab-Rel转录子的含量相对较多，表明Ab-Rel在鲍免疫反应中发挥积极的作用。 4．Ab-Rel在免疫反应中的功能与机理 半定量RT-PCR、Real-time荧光定量PCR、Norther杂交和EMSA的结果显示，大肠杆菌脂多糖(LPS)不能刺激鲍血淋巴细胞中Ab-Rel的表达，但可以使血淋巴细胞中NF-κB的DNA结合活性增加，表明鲍核转录因子Ab-Rel在免疫反应中具有调节作用，而其功能的激活发生在转录后。试验结果证明了NF-κB在鲍免疫反应中的作用，从而表明NF-κB信号通路在腹足类动物中的保守性。 5．Ab-Rel在昆虫细胞中的表达与亚细胞定位 利用Bac to Bac杆状病毒．昆虫细胞表达系统对Ab-Rel基因进行表达，通过与绿色荧光蛋白(EGFP)相融合，对Ab-Rel在昆虫细胞中进行了亚细胞定位。结果表明，鲍Ab-Rel基因能在昆虫细胞中获得表达，EGFP-Ab-Rel的融合蛋白定位于细胞核中。 6．双抗体间接ELISA检测鲍NF-κB 利用两个抗体对鲍NF-κB进行ELISA检测，与只用一个抗体的间接ELISA方法相比，该技术得利于抗体与抗原间有更多的结合位点，当加入酶标二抗和显色底物时，反应信号将会成倍放大。这种利用双抗体与二抗联用的间接ELISA方法更为灵敏，且操作简单，省时、省力，尤其适用于检测如NF-κB这样表达量较低的细胞因子。以此方法从蛋白水平上证明了Ab-Rel存在于鲍不同组织中，但血淋巴细胞中Ab-Rel蛋白的含量相对较多，进一步说明Ab-Rel蛋白在鲍免疫反应中的作用。 7．磁捕获技术在NF-κB分离与检测中的应用 本试验在上述研究的基础上提出一种新的磁捕获技术方案，用于分离和检测该DNA结合蛋白。通过优化实验条件，我们成功地从鲍血细胞蛋白中分离出了Ab-Rel蛋白。为了进一步证明该方法的实用性，我们对在昆虫细胞中表达的重组Ab-Rel蛋白进行分离，结果表明磁捕获技术不仅能有效地分离内源性NF-κB，而且对体外重组的NF-κB蛋白同样有效。因为只有具DNA结合活性的蛋白才能被捕获分离，所以磁捕获技术在分离蛋白的同时，还可以鉴定其活性。该技术的建立将有助于在蛋白水平研究NF-κB信号通路。

目录

致谢

引言

第一章核因子-κB结构和功能的研究进展

第二章鲍核转录因子Ab-Rel全长cDNA的克隆与序列分析

第三章Ab-Rel的原核表达，蛋白活性分析与鲍NF-κB分子结构的鉴定

第四章Ab-Rel的表达分析

第五章Ab-Rel在免疫反应中的功能与机理研究

第六章Ab-Rel在昆虫细胞中的表达与亚细胞定位

第七章双抗体间接ELISA检测鲍NF-κB

第八章磁捕获技术在NF-κB分离与检测中的应用

全文小结

参考文献

附录