脑恶性胶质瘤患者脑脊液中候选肿瘤标记物蛋白质峰值研究

摘要

胶质瘤占颅内原发性肿瘤的40～50﹪,其中高级别胶质瘤占胶质瘤的50﹪以上<'[1]>,而低级别脑胶质瘤患者几乎术后数年后都复发或进展为恶性胶质瘤而死亡.癌症患者中有20～40﹪发生脑转移<'[2]>,脑转移瘤做为脑内继发性肿瘤,发生率是颅内原发性肿瘤10倍<'[3]>,而脑转移瘤患者中有40～50﹪患者为单发病灶.恶性胶质瘤及脑转移瘤在影像学上往往都表现为肿瘤周边的强化,中心的坏死.脑转移瘤及恶性胶质瘤的临床诊断有时十分的困难. 随着蛋白组学的发展,特别是在质谱技术及蛋白质芯片基础上发展起来的SELDI-TOF-MS技术,能直接高通量地分析患者肿瘤组织及体液中蛋白表达情况.SELDI联合标志物敏感性和特异性较肿瘤单一标志物高<'[4][5][6]>.本研究应用SELDI-TOF-MS技术直截对脑恶性胶质瘤及脑转移瘤患者的脑脊液进行分析,建立脑脊液蛋白指纹诊断图谱,结合临床磁共振影像检查,用于临床脑转移瘤及恶性胶质瘤的鉴别诊断.同时基于以上脑恶性胶质瘤,脑转移瘤及脑非肿瘤患者脑脊液蛋白指纹图谱,应用无血清培养方法培养胶质瘤细胞,收集细胞外液,将细胞外液中蛋白表达峰与脑脊液中进行比较,确立脑恶性胶质瘤患者脑脊液中候选分泌蛋白峰值.从而为获得真正意义上的由肿瘤组织分泌的,能反映肿瘤细胞增殖侵袭的,复发特性的,特异性及灵敏度高的肿瘤标记物奠定基础. 研究目的： 建立脑胶质瘤与脑转移瘤脑脊液蛋白指纹诊断模型,基于脑恶性胶质瘤,脑转移瘤及脑非肿瘤患者脑脊液蛋白指纹图谱,结合恶性胶质瘤细胞无血清培养上清蛋白指纹图谱,确定候选鉴定蛋白峰值. 材料和方法: 1 材料: 1.1标本:61份脑脊液:胶质瘤25例,其中Ⅲ级15例,Ⅳ级9例,胶质瘤Ⅲ术后1例,胶质瘤Ⅳ级术后1例.脑转移瘤17例,可疑1例.非肿瘤患者脑脊液对照18例;胶质瘤Ⅳ级无血清原代细胞培养上清1例,胶质瘤Ⅳ级经36次传代后无血清培养,分别于培养24小时,48小时及72小时留取培养上清.同时在培养过成中加入蛋白酶抑制剂,在上述的三个时间点收集细胞外液.胶质瘤Ⅳ级经40次传代后无血清培养,于培养24小时留取培养上清.同时在培养过成中加入蛋白酶抑制剂,在上述的时间点收集细胞外液. 1.2设备:表面加强激光解吸电离.飞行时间质谱(PBS Ⅱ<'+>,Ciphergen Inc.美国). 1.3芯片:CMlO为WCX-2改进型,其表面有一层疏水性的涂层,因此兼具WCX-2和两种芯片的优点. 1.4应用软件和标志物评价指标:应用软件:SPSS 10.1软件,CiphergenSoftware 3.1和Biomarker Wizards;评价试验的指标:灵敏度、特异度. 2方法: 2.1脑脊液及培养上清样本处理:等体积的dilute solute稀释标本;按标本浓度运用binding buffer调浓度.运用50﹪SPA溶于50﹪乙氰及0.5﹪TFA作为基质. 2.2标本分组: 2.2.1脑脊液: ●组1:脑恶性胶质瘤(23)和脑转移瘤对照(17); ●组2:脑恶性胶质瘤(23)和非脑肿瘤患者(18). ●组3:脑转移瘤对照(17)和非脑肿瘤患者(18) ●组3:脑恶性胶质瘤术前(2)和对应患者术后(2)2.2.2培养上清 ●原代上清和传代上清的比较 ●培养上清不同时间点的比较 ●培养过程中加入及不加入蛋白酶抑制剂的比较2.3建模方法 ●初步筛选有统计学差异的m/z; ●生物信息学软件分析数据,进一步筛选用于建模的m/z; ●评价模型的敏感性、特异性.2.4候选分泌蛋白峰值的筛选 ●确立细胞培养上清中分泌蛋白峰值. ●依据分泌蛋白峰值,进一步选择在大部分脑恶性胶质瘤患者脑脊液中存在的峰值,同时在转移瘤及非肿瘤患者脑脊液中很少分布的峰值. ●检测候选的峰值在术后脑脊液中分布的情况 3结果: 3.1胶质瘤及转移瘤患者脑脊液蛋白质指纹图谱分析结果脑恶性胶质瘤与转移瘤比较,检测到170个m/z峰,分析胶质瘤与转移瘤指纹图谱的数据,以m//z位于3912.7851,8930.644的2个峰质荷比峰的组合,在测试集上分析判别模型的特异性为82.35﹪,敏感度为88.00﹪.3.2不同时间点细胞外液中蛋白峰值分布情况 ●无血清培养24小时后搜集的峰值有51个,加蛋白酶抑制剂的收集得到25个 ●无血清培养48小时后搜集的峰值有48个,加蛋白酶抑制剂的收集得到80个 ●无血清培养72小时后搜集的峰值有26个,加蛋白酶抑制剂的收集得到24个3.3胶质瘤细胞培养上清中蛋白峰值分布情况 ●胶质瘤细胞经40代传代培养后无血清培养24小时后收集细胞外液收集得到M/Z分别为2153.78,4100.91,9112.07,1.3672.26,59122.69,79992.74,88860.08峰值. ●细胞培养过程中加蛋白酶抑制剂后收集得到的M/Z峰值为:3231.11,4311.71,4361.23,5883.80,5995.94,6521.67,8424.99,9116.45,10050.51,13679.32,59066.09,88974.01. ●最终确立细胞外液中的分泌蛋白M/Z峰值为:2153.78,3231.11,4311.71,4361.23,5883.80,5995.94,8424.99,9116.45,10050.51,59066.09,88974.01.3.4确立脑恶性胶质瘤脑脊液中高丰度表达的分泌蛋白峰值: ●9075～9120:13例脑胶质瘤患者脑脊液中出现高表达,两例转移瘤患者脑脊液中出现高表达,一例非肿瘤患者脑脊液中出现高表达.胶质瘤术前术后出现差异表达,并且术后表达减少.原代,40代培养上清中都出现高表达. ●8.1KD～8.5KD:21例脑胶质瘤患者脑脊液中高表达,在8例脑转移瘤患者脑脊液高表达,在5例非肿瘤患者脑脊液中高表达.胶质瘤术前术后出现差异表达,并且术后表达减少. ● 10020KD～10070KD:10例脑胶质瘤患者脑脊液中高表达,6例脑转移瘤中高表达,5例非脑肿瘤患者中高表达.40代培养上清中高表达. 结论： 1.3912.7851,8930.644的2个峰质荷比峰的组合可以用于脑恶性胶质瘤与脑转移瘤的鉴别诊断. 2.下一步可尝试对细胞外液或脑脊液中候选分泌蛋白峰值为9100Da,8182Da,10050Da进行分离鉴定.对脑脊液中在诊断模型中存在的8930Da的蛋白峰值也可进行鉴定.

目录

缩略语说明

摘要

前言

试剂的配制、仪器设备、生物信息学分析软件介绍

第一部分：脑恶性胶质瘤与脑转移瘤脑脊液蛋白指纹诊断图谱的建立

第二部分 脑恶性胶质瘤患者脑脊液中候选分泌蛋白的筛选初步研究

参考文献

综述 胶质瘤分子生物学分类研究进展

附录

致谢