甲壳动物DNA甲基转移酶2（Dnmt2）基因的分子特征、表达分析及DNA甲基化水平检测

摘要

迄今为止，已知的真核生物DNA甲基转移酶(Dnmt)有三大家族：DNA．甲基转移酶1(Dnmtl)、DNA甲基转移酶2(Dnmt2)和DNA甲基转移酶3(Dnmt3)。这三大家族在蛋白质的分子结构上都具有十个较为保守的模体(motif)。在生物体内，它们以S-腺苷-L-甲硫氨酸为甲基化供体，催化DNA．上胞嘧啶的甲基化反应，从而实现对基因表达的调控。在这三大家族中，Dnmtl和Dnmt3的生物学功能较为清楚，它们是哺乳动物发育过程中必需的基因，它们的缺失会导致哺乳动物的死亡。然而，由于Dnmt2基因的缺失体都未表现出较为明显的表型变化，因此Dnmt2的生物学功能还尚未清楚。分析Dnmt2基因的结构与表达特征对研究其生物学功能有着重要的意义。 本研究以甲壳动物卤虫Artemia franciscana和罗氏沼虾Macrobrachium rosenbergii为研究对象，通过对Dnmt2基因的表达分析以及DNA甲基化水平的测定，阐明了Dnmt2基因的表达变化与卤虫和罗氏沼虾的胚胎发育有着密切的关系，但与DNA甲基化水平没有明显的相关性。本研究为Dnmt2基因在甲壳动物中功能的研究奠定了基础，其结果主要包括以下三个方面： 1．采用CODEHOP兼并引物方法，在甲壳动物卤虫和罗氏沼虾中分离得到 Dnmt2基因，并各自命名为AfDnmt2和MarDnmt2。我们获得的AfDnmt2 cDNA长度为1054-bp，包含了一个1140-bp长度的开放式阅读框(open reading frame，ORF)。此开放式阅读框编码379个氨基酸残基；MarDnmt2 cDNA全长为1472-bp，包含一个1191-bp长度的开放式阅读框，此开放式阅读框编码编码396个氨基酸残基。AfDnmt2和MarDnmt2各自编码的蛋白质与其它种类Dnmt2相比，均呈现出30％-40％的相似性、十个DNA甲基转移酶特征性的模体，以及一个目标识别域(target recognized domain， TRD)。这是首次在甲壳动物中报道Dnmt2基因，也是现今已知的唯一的甲壳动物Dnmt基因。并且，采用PCR和Southern Blotting方法，对 AfDnmt2在基因组上的结构进行分析，结果表明，AfDnmt2在基因组上不存在内含子，并且以多拷贝形式存在于卤虫基因组中。 2．我们采用半定量RT-PCR分析方法，检测AfDnmt2在卤虫休眠卵发育过程中的表达。结果显示，在卤虫休眠囊胚的孵化过程中，AfDnmt2 mRNA水平表现出明显的上升趋势，当休眠囊胚孵化10小时时，AfDnmt2 mRNA水平达到最高。接着，伴随着卤虫无节幼体的出现，AfDnmt2水平呈现明显的下降；对幼虫和成虫的AfDnmt2表达水平检测中发现，幼虫L7时期到幼虫L12时期，AfDnmt2 mRNA有一明显的下降过程。成熟的雌性卤虫与雄性卤虫之间，AfDnmt2 mRNA水平未出现较大的差异。采用C<'5>-甲基胞嘧啶抗体检测方法，对卤虫的基因组DNA甲基化水平进行测定。结果发现，卤虫DNA甲基化水平约为0.02％，AfDnmt2基因的表达变化与DNA甲基化水平没有明显的相关性。 3．我们采用荧光定量PCR的方法，对罗氏沼虾MarDnmt2进行表达特征研究，结果表明，MarDnmt2在罗氏沼虾的各个组织中均能检测到其表达，但是，卵巢组织中的MarDnmt2 mRNA水平最高，约是其它组织的5-16倍，呈现出组织特异性的表达方式。进一步对罗氏沼虾的胚胎发育过程研究发现，MarDnmt2 mRNA水平与罗氏沼虾胚胎发育有着密切的关系。即随着卵巢的发育，MarDnmt2 mRNA水平逐步上升，到卵巢最成熟时期，其表达量达到最高。之后，随着交配的完成，Dnmt2的表达在胚胎发育过程中，呈现一种下降的趋势。到蚤状幼体期时，其表达量约下降至最高时期的1/5。我们同样采用C<'5>-甲基胞嘧啶抗体检测方法，对罗氏沼虾DNA甲基化水平进行测定。结果发现，罗氏沼虾DNA甲基化水平约为0.05％， MarDnmt2基因的表达变化与DNA甲基化水平没有明显的相关性。

目录

论文说明：本文主要缩略词表

摘要

前 言

第一部分文献综述

1.DNA甲基化的研究概述

1.1 DNA甲基化在脊椎动物中的特征

1.2 DNA甲基化在脊椎动物生长发育过程中的研究

1.3 DNA甲基化在脊椎动物其它方面的研究

1.4 DNA甲基化在无脊椎动物中的特征

1.5 DNA甲基化在无脊椎动物中的研究

2.DNAC5-胞嘧啶甲基转移酶(DNA methy Itransferase,Dnmt)的研究概述

2.1 Dnmt的分子结构

2.2 Dnmt1

2.3 Dnmt2

2.4 Dnmt3

小结

参考文献

第二部分研究内容

第一章DNA 甲基转移酶2(Dnmt2)基因在卤虫、罗氏沼虾中的分子克隆及其在卤虫基因组上的结构分析

1.引言

2.材料

3.方法

4.结果

5.讨论

参考文献

第二章卤虫Dnmt2基因的表达特征与DNA甲基化水平检测

1.引言

2.材料

3.方法

4.结果

5.讨论

参考文献

第三章罗氏沼虾Dnmt2基因表达特征分析与DNA甲基化水平检测

1.引言

2.材料

3.方法

4.结果

5.讨论

参考文献

第四章结论与展望

1.结论

2.有待进一步开展的工作

第三部分本研究的创新点

第四部分附 录

致 谢