折叠酶DsbA的制备及协助蛋白质体外复性的研究

摘要

如何对富含二硫键的包涵体蛋白进行高效的体外复性是重组蛋白生产所面临的巨大挑战.DsbA是大肠杆菌周质胞腔中辅助多种含有二硫键的蛋白质正确折叠并具有生物学活性的一种二硫键异构酶.本文将DsbA质粒成功转化后,对转化子进行了发酵和纯化的优化,然后将制备的重组折叠酶DsbA初步应用于模型蛋白溶菌酶的体外复性之中. 首先,将含编码dsbA基因的质粒pAVD63转化到Ecoli BL21(DE3),目标蛋白DsbA获得了可溶性表达. 然后,利用统计实验设计的方法将生产重组DsbA的发酵过程进行了优化.通过Plackett-Burman设计挑选出了对DsbA表达量影响较大的4个因素,利用杂合设计进行实验,并通过拟合得到了响应曲面函数,但该函数的驻点是鞍点,因此不具有全局的极值.通过约束优化得到了较佳的实验点,在该实验点下DsbA的表达量比基本培养条件下提高了50.14﹪. 再次,离心收集细胞后进行超声波破胞,将细胞破碎的清液经过离子交换层析得到纯化的DsbA.为提高DsbA分离纯化的效率、回收率并缩短DsbA的制备周期,对离子交换层析过程利用Box-Behnken设计进行了统计优化,考察了pH值、洗脱梯度、初始盐浓度和上样量的影响.以DsbA洗脱峰面积为响应值,拟合出响应面函数,并利用多目标规划中的功效系数法综合考虑以上3个目标,得到了较优的实验条件为:20mL Q Sepharose Fast Flow凝胶柱,pH值为8.3,洗脱高盐含量(B液所占比例)为5.88﹪,初始盐浓度为16.7mM,上样量为9.25mL.验证实验表明,得到的DsbA洗脱峰面积为4301.8 mAu·mL,与模型预测的的相对误差仅为±2.4﹪.最终纯化后可得到377.9±1.74mg DsbA/L发酵液,蛋白收率为96.8﹪,纯度大于95﹪.通过肽质量指纹谱分析所得目标产物为高纯度的DsbA,分子量为23kD. 最后,将DsbA应用于模型蛋白溶菌酶的复性过程中.利用Plakett-Burman设计考察了影响复性后溶菌酶蛋白回收和比活的9个因素,筛选出5个重要因素:初始溶菌酶浓度、尿素浓度、KCl浓度、GSSG浓度、GSH与GSSG摩尔比,并进一步对这5个重要因素进行了考察.在优化的复性条件下,当初始溶菌酶浓度为250μg/mL时,DsbA介导体系复性效果大大高于直接稀释复性的结果,溶菌酶活性回收率从44.52﹪提高到75.85﹪,为富含二硫键的包涵体蛋白体外复性提供了一种新的方法.

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1.1引言

1.2包涵体及蛋白质复性

1.2.1包涵体的形成

1.2.2包涵体蛋白的分离、纯化及溶解

1.2.3蛋白质的体外复性方法

1.2.4两种蛋白质折叠学说

1.3折叠酶—DsbA

1.3.1二硫键的形成

1.3.2 Dsb家族蛋白及DsbA简介

1.3.3 DsbA的结构

1.3.4 DsbA的性质

1.3.5 Dsb家族中各成员的协同作用

1.3.6 DsbA协助蛋白质复性的研究

1.4本文的研究内容

第二章质粒转化及菌种筛选

2.1实验材料和仪器

2.1.1质粒和宿主菌

2.1.2溶液

2.1.3培养基

2.1.4实验仪器

2.2实验方法

2.2.1质粒抽提

2.2.2感受态细胞的制备

2.2.3质粒的转化

2.2.4转化子筛选

2.2.5菌种保存

2.3实验结果及讨论

2.3.1菌种的筛选

2.3.2转化成功的检测

2.4本章小结

第三章折叠酶DsbA在大肠杆菌中表达条件的统计优化

3.1实验材料和仪器

3.1.1菌种和试剂

3.1.2培养基

3.1.3实验仪器

3.2实验方法

3.2.1培养过程

3.2.2分析方法

3.3实验设计

3.3.1筛选实验——Plackett-Burman设计

3.3.2优化实验——杂合设计(Hybrid design)

3.3.3验证实验

3.4数据处理法

3.4.1筛选实验的数据处理

3.4.2响应面的拟合与分析

3.5实验结果与讨论

3.5.1发酵中重要影响因素的确定

3.5.2发酵最佳操作点的确定

3.6本章小结

第四章折叠酶DsbA的纯化

4.1实验材料和方法

4.1.1缓冲溶液

4.1.2凝胶

4.1.3实验仪器

4.2实验方法

4.2.1分析方法

4.2.2细胞破碎

4.2.3离子交换层析

4.3实验结果与讨论

4.3.1响应曲面的拟合

4.3.2最佳操作条件的确定

4.3.3优化后的验证实验

4.4本章小结

第五章折叠酶DsbA协助溶菌酶体外复性初步研究

5.1实验材料和仪器

5.1.1试剂

5.1.2缓冲液

5.1.3实验仪器

5.2分析方法

5.2.1 RP-HPLC分离和测定蛋白质浓度

5.2.2溶菌酶活性测定方法(F.I.P.法)

5.3实验设计与方法

5.3.1溶菌酶的变性处理

5.3.2筛选实验——Plackett-Burman设计

5.3.3重要因素考察实验

5.3.4 DsbA的固定化方法

5.4数据处理

5.5实验结果与讨论

5.5.1影响溶菌酶复性过程的因素

5.5.2重要因素的筛选

5.5.3重要因素的考察

5.5.4 DsbA介导体系与稀释复性结果比较

5.5.5 DsbA固定化复性溶菌酶结果

5.6本章小结

第六章结论与建议

6.1结论

6.2建议

参考文献

致谢