杜仲叶提取物对MC3T3-E1细胞体外作用及其机制的实验研究

摘要

背景: 颌骨可因外伤、肿瘤、炎症等多种因素而造成骨缺损,颌骨缺损除直接导致颜面畸形外,还可引起严重的功能障碍,给病人造成语言、吞咽等功能的障碍,及在生理、心理、社会等方面的不良影响.自1912年Macewen报道利用自体肋骨修复下颌骨缺损获得成功以来,各国学者在颌骨缺损重建方面进行了大量的研究. 颌骨缺损传统的治疗方法主要是骨移植,其中包括自体骨移植、异体、异种骨移植和人工骨代用品.近年来,随着生物学和材料科学的发展,组织工程学作为高新技术新领域的一门多学科交叉的新兴边缘学科随之应运而生,并得到了迅速的发展,利用组织工程学方法构建的组织工程骨已成为骨移植的又一研究热点. 杜仲,为杜仲科植物杜仲(Eucommia ulmoids Oliv.)的干燥树皮,是我国特有的名贵中药,中国药典规定其树皮作为中药杜仲入药.杜仲皮一般需生长15-20年,而叶的资源相对丰富易得,研究证实杜仲叶与皮的化学成分基本一致,具有同等功效,可以以叶代皮<'[1]>,具有补肝、肾、强筋骨等作用.杜仲叶的化学成分为:1)苯丙素类化合物:包括谷甾醇(13-sistoster01)、熊果酸(ursolicacid)、绿原酸(chlorogenic acid).2)环烯醚萜类:杜仲醇(eneommiol)、京尼平苷酸(geniposidic acid)、京尼平苷(geniposide)、桃叶珊瑚苷(aucubin).3)黄酮类:山奈酚(kaempferol)、斟皮素(quercetin).<'[2]>研究表明,杜仲叶提取物的有效成分对成骨细胞的增殖具有明显的促进作用<'[3]>. 机体在外伤等应激条件下都会由超氧化物歧化酶(SOD)、氧化酶等催化产生活性氧(reactive oxygenspecies,ROS),如超氧阴离子(02)、过氧化氢(H202)、羟基自由基(HO·)等<'[4,5]>.这对于细胞信号传递、吞噬细胞的功能及创口愈合的快慢都有重要的作用<'[6]>. 目的: 探讨不同浓度的杜仲叶提取物对体外培养的成骨细胞增殖作用的影响,并根据其体外活性测试的结果,选择杜仲叶提取物最佳成骨作用浓度;探讨杜仲叶提取物(Euec)对H<,2>O<,2>诱导所致的成骨细胞凋亡的抑制作用及其分子机制. 方法: 通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法进行纽胞毒性实验,流式细胞计数法进行细胞增殖实验,以探讨杜仲叶的成骨作用;以H<,2>O<,2>诱导小鼠成骨样细胞(MC3T3-E1)氧化损伤,建立细胞凋亡模型,经适当浓度Euec的干预,采用Western blot,RT-PCR方法测定细胞的存活率,细胞的凋亡率,半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3、-6、-7、-9的相关凋亡蛋白及基因表达.探讨Euec对H<,2>O<,2>所致MC3T3-E1凋亡的抑制作用及其可能的机制. 结果: 由实验可知:800umol/L的H<,2>O<,2>可致使MC3T3-E1细胞凋亡;杜仲叶提取物(Euec)(6.25ug/ml)可显著抑制H<,2>O<,2>所致细胞的氧化损伤,提高细胞的存活率;可明显降低细胞中凋亡细胞百分比;可抑制半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7、Caspase-9的蛋白和基因表达. 结论: Euec对MC3T3-E1的增殖有促进作用,可以用于骨缺损修复;Euec能明显抑制H<,2>O<,2>诱导的MC3T3-E1细胞的凋亡作用,减轻MC3T3-E1细胞的氧化损伤,其机制可能与抑制Caspase-3、-6、-7、-9的激活有关.

目录

总论

第一部分杜仲叶提取物对MC3T3-E1细胞的增殖作用

引言

材料与方法

结果

讨论

第二部分杜仲叶提取物对H2O2诱导的MC3T3-E1细胞凋亡的抑制作用及其分子机制

引言

1.材料与方法

实验结果

3、讨论

全文总结

参考文献

杜仲叶化学成分和成骨活性等药理作用研究进展

在读期间发表的论文

附录

致谢