TRX与STAT-3在肝细胞肝癌高表达及相互作用研究

摘要

背景:据统计,全世界每年新发肝癌26万例,其中42.5﹪在中国,中国肝癌死亡率为20.4/10万,在原发性肝癌中肝细胞肝癌约占91.5﹪,因此加强对肝细胞肝癌的发生发展因素的研究将会对肝癌的预防,诊断及治疗等方面具有更加普遍的意义.我们已知肝细胞肝癌的发生发展是多基因突变、多阶段的演进过程,但我们却很难确定在这一过程中每一个已突变的基因或未突变而可能突变基因的作用及与或对另外某一或某些基因在肝细胞肝癌发生发展中的可能的作用机制及功能,虽然目前在这个方面的研究已经展开但却不够深入,只有通过对这些在肝细胞肝癌发生发展中起着重要作用的基因之间的联系的深入研究才能使我们对肝细胞肝癌的发生发展有着更加深入的认识,对肝细胞肝癌诊断及治疗等具有重大的指导作用. 硫氧还蛋白(Thioredoxin,TRX)是一种小分子含硒蛋白质,分子量约为12kD.其广泛存在于原核、真核生物中,它与硫氧还蛋白还原酶(TRXR)、还原型烟酰腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)三者共同组成硫氧还蛋白系统而发挥作用.信号转导和转录激活因子(signal transducers and activators 0f transcription,STATs)是研究干扰素诱导基因转录时首次鉴定的一个胞浆蛋白家族.两者共同参与了某一或某些细胞状态的调节,由此我们推测这种可能的相互作用机制也可能存在于肝细胞肝癌中而且发挥着某些功能,而这些功能将对肝细胞肝癌发生发展产生不容忽视的影响,如果我们能够阐明两者之间的相互作用机制及功能将会为临床开展对肝细胞肝癌发生和发展的认识及诊断和治疗等产生重大的指导作用. 方法： 1 收集浙江大学医学院附属第一医院外科手术切除的肝细胞肝癌的标本30例,所有标本均取自首次切除肝细胞肝癌的患者,术前均未接受放疗或化疗.所有标本均在肿瘤切除后30 min内采集,同时取包括癌组织及距癌灶5cm以上的癌旁组织,距癌组织边缘10cm处的正常组织包括部分硬化组织,所取组织迅速冻存于液氮并保存在-80℃,以便提取mRNA及蛋白,以上所有标本均经临床和病理诊断证实,具有完整的病例资料,标本保存于外科实验室. 2 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测mRNA的表达取约50mg组织应用TRIzol法常规提取总RNA,经紫外微量分光光度仪定量后,取2μg总RNA,随机引物法逆转录合成cDNA.以β-actin作为内参照,进行半定量聚合酶链反应(PCR)扩增.结合临床资料按因素进行实验分组并分别进行实验,严格控制实验误差在有效范围内.TRX引物(扩增产物为383bp)上游5＇-AAGCCTTGGACGCTGCAGGt-3＇,下游5＇-GTCACGCAGATGGCAACTGG-3＇;STAT-3引物(扩增产物为226bp)上游:5＇-AACTCTTGGGACCTGGTGTG-3＇,下游5＇-AAGGTGCCTGGAGGCTTAGT-3＇;β-actin引物(扩增产物为524bp)上游:5＇-TAGAAGCAGTFGCGGTGG-3＇,下游5＇-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3＇.PCR扩增条件为:95℃预变性4 min,33个循环{95℃45 s-(TRX 57℃,45 s),(STAT-3 64.5℃,45 s),(β-actin57℃,45 s)-72℃,45s},72℃充分延伸10min,取扩增产物5μl,在溴化乙锭染色、1.5﹪琼脂糖凝胶下100 V电泳45 min,以Kodak DNA Analysis 2.0凝胶图像分析系统处理,读取目的条带和内参的光密度值,结果以比值(样本光吸收度A值/内参照光吸收度A值)表示. 3 Western blotting检测蛋白表达水平取约50mg组织研磨后,加入1ml预冷组织裂解液(10mM Tris-HCl,0.25mMSucroce,5mM EDTA,50mM NaCl,30mM焦磷酸钠, 50mM NaF,1mMNa3VO4,2﹪CocKtail),冰上静置1小时,4℃低温12000转离心30分钟,取上清液,Bio-Rad蛋白测定试剂盒(BCA)测定蛋白浓度.取4μg蛋白样品加4×上样缓冲液,100℃煮4分钟变性后,结合临床资料按因素进行实验分组并分别进行实验,严格控制实验误差在有效范围内.行12﹪聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白质,电转移法将蛋白质转移到PVDF膜,用含5﹪脱脂牛奶的TBS封闭1小时,加入一抗(1:1000稀释),摇床上反应1小时后4℃冰箱中过夜,TB3ST液洗膜5分钟×3,加入二抗中(1:2000稀释),反应2小时,TBST洗膜5分钟×3次后作ECL,化学发光,X片(Kodak)曝光显影.Kodak DNA Analysis 2.0凝胶图像分析系统测定目的显影条带和内参照β-actin的光吸收度A值,结果以比值(样本光吸收度A值/内参照光吸收度A值)表示. 4统计学分析 实验结果采用SPSS13.0统计软件分析.定量资料采用X±s表示,两组比较用f检验;多组比较用方差分析,偏态分布用非参数检验,指标之间用Spearman等级相关分析,P<0.05为差异有统计学意义. 结果： 1.肝细胞肝癌、癌旁及正常肝组织中TRX和STAT-3的表达:30例标本mRNA及蛋白均有不同程度表达,TRX和STAT-3在肝癌组织中为高表达在癌旁及正常组织为低表达并呈递减趋势,其差异具有统计学意义(P<0.05). 2.TRX和STAT-3的表达与肝细胞肝癌临床病理特征关系:二者mRNA及蛋白表达随着肝细胞肝癌组织分化程度降低而有增高的趋势,其差异具有统计学意浙江人学医学院附属第一医院SL(P<0.05),而与肿瘤大小,个数,瘤栓,血管侵犯,微转移灶及复发转移无显著相关. 3 TRx和STAT-3表达失衡相关性研究:TRx和STAT-3表达为正相关mRNA结果为(r=0.380,P=0.038)蛋白结果为(r=0.468,P=0.009). 结论 1.TRX和STAT-3在肝细胞肝癌中较之癌旁及正常组织高表达,及正常组织表达呈递减趋势. 2.TRX和STAT-3在不同分化的肝细胞肝癌组织表达具有差异,肝癌发生发展有关.二者在癌,癌旁提示其与肝细胞. 3.TRX和STAT-3两者在肝细胞肝癌表达具有正相关关系,两者各自单独或两者之间的相互作用可能参与了肝细胞肝癌的恶性进程.

目录

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 TRX与STAT-3在肝细胞肝癌研究中进展

附：发表的文章

致谢