白花蛇舌草中Src蛋白激酶抑制成分的分离鉴定

摘要

蛋白酪氨酸激酶能催化ATP上的磷酸基团转移到其它重要蛋白质的酪氨酸残基上，使其发生磷酸化。在细胞内参与信号传导，与细胞生长、分化、死亡等一系列生理生化过程密切相关<'[3,4]>。有资料表明蛋白酪氨酸激酶的异常与肿瘤相关。如本文使用的靶蛋白v-Src蛋白具有极强的转化效应，并能诱导细胞迁移；c-Src蛋白时空上表达的紊乱及引起的信号转导异常被认为是结肠癌、乳腺癌、成纤维细胞瘤等发生、发展的原因之一<'[5,6]>。目前，以蛋白酪氨酸激酶为靶点的药物研发是抗肿瘤药物研究的一个热点方向。已有十多种蛋白酪氨酸激酶抑制剂和抗体进入I-Ⅲ期临床试验阶段，个别的已经上市，如以：Bcr-Abl/PDGFR为靶点的Gleevec(STI571)、以EGFR为靶点的Iressa(ZD1839)和Eflotinib(OSI-774)。 本文在体外以Src蛋白为靶位点，从抗癌中草药白花蛇舌草(HedyotidisDiffusae)中筛选得到两种具有蛋白酪氨酸激酶抑制活性的葸醌类化合物。首先，利用本实验室已经构建成功的含v-Src目的基因片断的工程菌株E．coli．BL21(DE3)laGEX-KT/v-src，经菌株鉴定、表达条件优化等工作，用IPTG诱导大量表达GST-v-Src蛋白，收集包涵体蛋白，并经变性复性处理，获得具有酪氨酸激酶活性的融合蛋白。其次，建立以生物素化的聚Glu：Tyr(4：1)为激酶反应底物、利用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的磷酸酪氨酸特异性单克隆抗体(HRP-PY20)检测磷酸酪氨酸残基的酶联免疫吸附反应(enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)，以Src蛋白为筛选靶位点的蛋白酪氨酸激酶抑制剂体外快速筛选模型。再者，用硅胶柱层析、硅胶薄层层析等方法，分离纯化中草药白花蛇舌草，并从中筛选得到两种具有明显Src蛋白酪氨酸激酶抑制活性的成分。质谱(MS)、红外光谱(IR)、紫外光谱(UV)、核磁共振(<'1>H NMR、<'13>C NMR、HMQC)等检测鉴定结果表明，两化合物分别为2-甲基-3-羟基葸醌(2-methyl-3-hydroxyanthraquinone)、 2．甲氧基-3-羟基葸醌(2-methoxy-3-hydroxyanthraquinone)。细胞毒性实验表明，两化合物对肝癌细胞HepG2、肺腺癌细胞SPC-A-1、乳腺癌细胞Bcap37具有明显生长抑制作用。

目录

论文说明：英文缩写词表

摘要

第一篇论文综述Src蛋白酪氨酸激酶及其抑制剂的最新研究进展

前言

1 src基因与Src蛋白结构

1.1 src基因的发现

1.2 src基因的结构特征

1.3 Src蛋白结构域组成

1.4 Src蛋白空间结构

2 Src蛋白的激酶活性及分子内调节

2.1 Src蛋白激酶活性的发现

2.2 Src蛋白Tyr527磷酸化对激酶活性的影响

2.3 Src结构域相互作用对激酶活性的影响

3 Src蛋白与肿瘤的关系

3.1 Src蛋白与肿瘤发生

3.2 Src蛋白与肿瘤侵染

3.3 Src蛋白与肿瘤转移

4酪氨酸激酶抑制剂的作用途径

4.1竞争性抑制ATP结合

4.2结合蛋白功能区

4.3抑制蛋白合成

4.4 Src蛋白酶解

5酪氨酸激酶小分子抑制剂

5.1 STI571的发现

5.2 STI571的作用机理

5.3 STI571对底物的特异性

5.4 STI571临床研究

5.5 ZD1839和OSI-774

6酪氨酸激酶抑制剂的作用

6.1抗肿瘤增殖的作用

6.2抗肌肉收缩作用

6.3抗血小板凝集作用

6.4对细胞代谢的影响

6.5对钙化的影响

第二篇实验研究白花蛇舌草中Src蛋白酪氨酸激酶抑制成分的筛选鉴定

前言

1实验材料及仪器

1.1菌种

1.2酶

1.3分子量标准

1.4试剂盒来源

1.5缓冲液及其他溶液配方

1.6液体培养基和固体培养基

1.7其它主要试剂和商品来源

1.8主要仪器及设备

2实验方法

2.1 GST-v-Src菌种鉴定

2.2 GST-v-Src融合蛋白的诱导表达

2.3包涵体纯化、复性

2.4蛋白浓度测定

2.5酪氨酸激酶活性测定

2.6白花蛇舌草中Src抑制成分的提取

2.7肿瘤细胞毒性实验

3实验结果

3.1菌种鉴定

3.2 Src融合蛋白的表达及纯化

3.3白花蛇舌草中有效成分的分离纯化

3.4酪氨酸蛋白活性的检测

3.5单一有效成分的结构鉴定

3.6肿瘤细胞毒性作用

4实验讨论

4.1目的蛋白原核表达

4.2吸附层析的洗脱(展开)

4.3蒽醌类化合物的结构鉴定

4.4肿瘤细胞杀伤力与内源Src表达量的关系

4.5创新点

4.6总结和展望

参考文献

硕士研究生期间发表论文

致谢