嗜热脂肪地芽孢杆菌脂肪酶基因的克隆、表达及酶学性质研究

摘要

脂肪酶(三脂酰甘油酰基水解酶,EC 3.1.1.3)广泛存在于动植物和微生物中,可催化三脂酰甘油的酯键水解,也可催化酯化、酯交换、醇解、酸解等反应,在洗涤剂工业、食品加工、皮革造纸等方面具有广泛应用.近年来,来自嗜温和嗜热微生物的热稳定脂肪酶的基本性质和工业应用倍受关注,其中主要来源之一是2001年新命名的嗜热脂肪地芽孢杆菌.但由于野生菌产脂肪酶能力低,主要研究方向集中于采用基因工程方法构建重组菌,通过表达来获得相应的脂肪酶.本课题亦采用此方法,在大肠杆菌中克隆并表达嗜热脂肪地芽孢杆菌脂肪酶基因. 本文首先在由胰蛋白胨、酵母提取物、牛肉浸膏、NaCl组成的培养基中65℃条件下培养野生型嗜热脂肪地芽孢杆菌,收集菌体后采用合适的方法提取野生菌基因组作为PCR扩增模板,Pfu酶作DNA聚合酶,扩增得到约1.3kb条带,与pMD18-T Simple Vector连接进行TA克隆测序,验证目的基因得到正确扩增. 表达载体pET28c(+)及TA阳性克隆用BamHⅠ、NdeⅠ双酶切后,经T4DNA连接酶连接构建得到碱基数为6590bp的重组质粒pET28c(+)-lipase,在DH5a中得到高效扩增. 克隆成功后,将重组质粒转化E coli BL21(DE3)中表达,经SDS电泳与脂肪酶活性测定验证脂肪酶得到有效表达.对重组菌表达条件进行优化,培养至OD600在1.0左右,加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L,28℃诱导6小时,以橄榄油为底物,脂肪酶酶活达到1.88U/mg. 最后对重组菌Ecoli BL21(DE3)/pET28c(+)-lipase所表达的脂肪酶的一些性质和影响酶活的因素进行了初步考察:在pH 8.5的Tris-盐酸缓冲液(0.05mol/L)中,55℃条件下酶活最高,55℃时半衰期约8小时,10mM的Zn2<'2+>、Fe<'2+>对酶的抑制显著,10mM的PMSF与粗酶液混合30分钟后酶活几乎完全被抑制.

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1.1引言

1.2脂肪酶概述

1.2.1脂肪酶的研究历史简介

1.2.2脂肪酶来源

1.2.3脂肪酶的催化特点

1.2.4脂肪酶的应用

1.2.5国内外研究现状与发展趋势

1.3脂肪酶基因的克隆与表达

1.3.1微生物脂肪酶的基因特点

1.3.2大肠杆菌表达系统

1.4脂肪酶活力测定方法

1.4.1滴定法

1.4.2比色法

1.4.3荧光法

1.4.4其他方法

1.5论文思路及主要内容

第二章 嗜热脂肪地芽孢杆菌脂肪酶基因克隆

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1菌种、载体及试剂

2.2.2主要仪器

2.2.3培养基及抗生素

2.2.4 DNA提取方法

2.2.5 PCR扩增

2.2.6琼脂糖凝胶核酸电泳及片段回收

2.2.7限制性内切酶双酶切

2.2.8转化

2.2.9 TA克隆

2.2.10重组质粒构建

2.3结果与讨论

2.3.1嗜热脂肪地芽孢杆菌培养

2.3.2嗜热脂肪地芽孢杆菌基因组提取

2.3.3嗜热脂肪地芽孢杆菌脂肪酶基因PCR扩增

2.3.4感受态细胞制备

2.3.5 PCR产物TA克隆

2.3.6重组质粒构建

2.4小结

第三章 重组菌表达脂肪酶条件的初步优化研究

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1菌种、质粒及试剂

3.2.2主要仪器

3.2.3培养基、抗生素及诱导剂

3.2.4质粒提取及转化

3.2.5样品预处理

3.2.6聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

3.2.7蛋白质含量的测定

3.2.9脂肪酶活力测定

3.2.10表达条件优化方法

3.3结果与讨论

3.3.1重组质粒转化表达宿主菌

3.3.2蛋白质含量标准曲线

3.3.3脂肪酶活力测定

3.3.4表达条件优化

3.4小结

第四章 重组嗜热脂肪地芽孢杆菌脂肪酶的酶学性质和影响活性因素的初步研究

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1菌种及试剂

4.2.2主要仪器

4.2.3重组菌培养及样品处理

4.2.4缓冲溶液配制

4.2.5 pH对重组菌表达的脂肪酶的酶活的影响

4.2.6温度对重组菌表达的脂肪酶的酶活的影响

4.2.7重组菌表达的脂肪酶的温度稳定性考察

4.2.8金属离子对重组菌表达的脂肪酶的酶活的影响

4.2.9抑制剂对重组菌表达的脂肪酶的酶活的影响

4.3结果与讨论

4.3.1 pH对重组菌表达的脂肪酶的酶活的影响

4.3.2温度对重组菌所表达脂肪酶酶活的影响

4.3.3脂肪酶的温度稳定性

4.3.4金属离子对酶活的影响

4.3.5抑制剂对酶活的影响

4.4小结

第五章 结论与展望

5.1结论

5.2展望

参考文献

致谢