外源性EGF促细胞增殖作用的信号转导机制和安全性研究及EGF药源开发

摘要

表皮生长因子(epidermal growth factor,缩写EGF)，是一强有力的细胞分裂因子，主要由颌下腺管细胞分泌。 EGF对上皮细胞有促增殖作用，外源性EGF在临床中的应用开始于创伤治疗方面：如体表创伤、溃疡，角膜损伤等。由于人体大多数的EGF存在于消化道，远远高于循环中的EGF浓度，因此，EGF对消化道黏膜有效的保护作用使外源性EGF用于消化道疾病治疗成为了一个研究热点。研究同时也发现EGF和EGF受体(EGFR)拮抗剂可以影响肿瘤的发生、发展和消退，因此在临床中EGF的应用由于它潜在的安全性问题而受到了制约。由于EGF与EGFR激活及其信号转导通路十分复杂，病理生理功能多样，而Bel-2、p53基因蛋白表达异常与肿瘤发生、发展有关，故迫切需要进一步研究它们在基础研究和临床实践中的地位。文的内容分以下两个部分： 第一部分：外源性EGF促FL细胞增殖作用的信号转导机制及其安全性评价研究 目的：探讨EGF促FL细胞增殖时激活Ras/Raf/IVIEK/ERK信号转导通路时间一剂量-效应关系及对Bcl-2、p53蛋白表达的影响。 材料与方法： 1.MTT法检测细胞增殖：细胞以2×108/L的密度接种于96孔板上，每孔100μl。待细胞贴璧生长后换含不同浓度rhEGF(0.1、1、10、30、60 μg)的无血清培养基继续培养，对照孔以生理盐水代替rhEGF。观察细胞生长形态学变化并分别在第1、2、3、4、5 d取样；或换含rhEGF(10μl/L)+不同浓度PD98059(25、50、75 μmol/L)的MEM培养基100μl，继续培养48 h。取样后每孔加入MTT20μl，孵育4 h后弃上清，每孔加150 μlDMS0，振荡10 min，于酶标仪490nm波长下测定各孔的吸光度A值。细胞增殖率：(实验组A值一对照组A值)/对照组A值×100％。 2.Western蛋白印迹法检测Ras/Raf/MEK/ERK通路及Bcl-2、p53蛋白水平：待细胞贴璧生长后换用rhEGF终浓度为1、10、60 μl/L无血清的MEM培养基继续培养；测定MAPK通路抑制剂PD98059的影响则分别加入终浓度为25，50，75μmol/L的PD98059，预处理1 h。实验开始后根据需要在不同时段用胰酶消化，收集细胞并加细胞裂解液，取上清液，Bradford法测蛋白浓度。每孔加50μg的蛋白样品电泳，电泳结束后转PVDF膜，将转有蛋白的膜置于5％BSA封闭，经一抗和HRP标记的二抗处理后，在暗室，取ECL发光试剂A、B液各1ml，混合后覆盖于膜上1.5 min，最后用X光胶片进行曝光、显影及定影。 结果： 1.FL细胞经培养48小时后，生理盐水对照组基本以多边形居多，而加入rhEGF后细胞以长条纺锤形居多。 2.第l～5天中，1～60 μg几浓度组促细胞增殖率明显增高(P<0.01)。rhEGF浓度10 μg几第3天时达到最高(42.4％，P0.05)；而2h后p-ERK1/2表达的水平甚至低于刺激前的水平(P<0.05)。 6.与对照组比较，灰度分析结果示各浓度组PD98059(25，50，75 u mol/L)可明显抑制rhEGF促p-ERK1/2蛋白诱导表达(P<0.01)。且PD98059抑制p-ERK1/2蛋白的表达有剂量依赖性，随着PD98059剂量的加大，抑制p-ERK1/2蛋白表达的作用增强。 7.与对照组比较，受不同浓度rhEGF刺激1 h后Bcl-2蛋白表达灰度分析结果示1～60 μg/L浓度组Bc卜2蛋白表达较对照组明显增高(P<0.05)；rhEGF 1～60 μg几浓度组p53蛋白明显下降(P<0.01)。其中rhEGF1 μg/L浓度组的作用最弱，10 μg/L浓度组的最强，两组之间比较有显著差异(P<0.01)。 8.以rhEGF 10 μg/L的刺激浓度观测0 min，30 min，1 h，2 h，4 h五个时间段的Bcl-2蛋白诱导表达结果示30 min~4 h时间段的表达呈峰型曲线，以1h时间段的表达最高(P<0.01)，随后开始下降。与rhEGF 10μg几的浓度刺激后p-ERK1/2蛋白的表达水平比较，各时间段Bcl-2与p-ERK1/2的峰型变化曲线基本一致。 结论： EGF促FL细胞增殖、激活Ras/Raf/MEK/ERK信号转导通路及对Bcl-2、p53蛋白的表达有明显的剂量和时间依赖性作用。EGF浓度10μg几是最强的刺激浓度，FL细胞对此浓度EGF的刺激具有自适应控制作用。1μg几浓度的EGF可能是既发挥生理效应又较为安全的用量。 第二部分：羊颌下腺表皮生长因子提取、纯化及生物活性鉴定的研究 目的：从山羊颌下腺分离、纯化具有生物学活性的EGF。 方法： 1.羊EGF的提取、纯化：首先进行EGF的粗分离，称取山羊颌下腺(新鲜或冷冻)，解冻后剪去结缔组织，用剪刀剪成小块，用搅拌机搅碎，然后放入匀浆器匀浆，按比例加入冰醋酸(HAC)，操作在4℃冰浴中进行50 000×g，离心30 min，抽取上清液。进行DEAE Sphacel阴离子交换柱分离，收集洗脱液，UV-280hm检测图分析吸光度，选出的管数做ELISA实验。并以0.2 M醋酸铵和EGF标准品做为阴性、阳性对照，以检测EGF活性成分。不加硫酸(在652nm处的读数)及加酸后(在450nm处读数)的结果分析。读数高、和EGF标准品读数接近为有EGF活性组份的可能，将这些组份合并后进行透析脱去盐分(透析袋分子量为3 500)，透析过夜。将透析好的组份分别用甘油(丙三醇)或聚乙二醇(分子量20 000)进行浓缩以除去水分。透析浓缩后的组份再次进行EIASA实验。将含有EGF成分的浓缩液过分子筛色谱(Sephadex G50)柱层析，根据层析图所示，选取对应的收集管再次进行ELISA实验，步骤同前，结果吸光度值高的几管与层析图中的一个峰所对应，因此该峰就是含有EGF的活性峰。 2.对提取、纯化的羊EGF进行生物活性检测 2.1 MTT法测定不同浓度羊EGF对人胚胎羊膜细胞FL的促增殖作用。 2.2流式细胞术检测羊EGF促细胞增殖时细胞周期变化。 3.纯化的山羊颌下腺EGF行SDS—PAGE电泳观测其可见的分子量条带位置。 结果： 1.48小时后贴璧生长的FL细胞逐渐以多边形居多，而加入EGF后细胞以长条纺锤形居多。 2.MTT法促增殖实验：结果显示不同浓度羊颌下腺EGF组(稀释倍数：1：100、1：500、1：1000)、rhEGF(10μg几)组对FL细胞的促增殖率分别为20.90％、39.43％、24.90％和40.60％。与对照组比较，羊颌下腺分离的EGF可明显促进FL细胞的生长(P<0.01)，以稀释1：500倍的羊EGF作用效果最强，其促FL细胞增殖率与人重组EGF比较无明显差异(P>0.05)。 3.流式细胞术：根据细胞实验中确立的最佳羊EGF稀释浓度观测流式细胞术中羊EGF对细胞周期的影响，与对照组相比较，结果显示作用48 h后，G0/G。期细胞百分比由71.1±1.9减少至60.3±2.2(P<0.01)，S期细胞百分比由18.8±1.4增高至25.8±1.1(P<0.01)，纯化的山羊颌下腺EGF显著刺激细胞由G0/G。期进入S期，使分布在S期的细胞数增加。 3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：电泳结果显示在分子量6 kD处，可见明显的条带。 结论： 从山羊颌下腺分离得到的蛋白质经鉴定为EGF，该EGF能明显促进FL细胞生长、显著提高细胞的S期细胞分数，为具有生物学活性的EGF。羊颌下腺可能成为外源性EGF的药源。

目录

论文说明：缩略语

研究背景

第一部分：外源性EGF促细胞增殖作用的信号转导机制及其安全性研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分羊颌下腺表皮生长因子的提取、纯化及活性鉴定

前言

实验材料

结果

讨论

结论

参考文献

表皮生长因子及其受体与胃肠道临床

致 谢