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木鳖子提取物对于口蹄疫、禽流感及法氏囊疫苗的免疫佐剂作用研究

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论文说明:图表目录

Chapter-1 General introduction

1.1 Importance

1.2 Hypothesis

1.3 Structure of the study

1.4 Aims of the thesis

1.5 References

Chapter-2 Literature review

2.1 Immunity and immune responses

2.1.1 Innate immune responses

2.1.2 Adaptive immune responses

2.2 Improvement of vaccine potency

2.2.1 Adjuvants

2.2.2 Importance of adjuvants

2.2.3 Role of adjuvant in modulation of immune responses

2.2.4 Classification of adjuvants

2.2.5 Most common adjuvants

2.3 Effects of some saponins on animal immune system

2.3.1 Saponins

2.3.2 Effects on immune system

2.3.3 Mechanism of action

2.4 Some saponins with adjuvant properties

2.4.1 Quillaja saponaria

2.4.2 Ginseng

2.4.3 ISCOM

2.4.4 Astragalus saponin

2.4.5 Others

2.5 Momordica cochinchinensis

2.5.1 Fruit

2.5.2 Root

2.5.3 Seed

2.6 References

Experimental section

Chapter-3 Adjuvant effect of ECMS on the immune responses to FMDV(Asia-1) vaccination in mice Summary

3.1 Introduction

3.2 Materials and methods

3.3 Statistical analysis

3.4 Results

3.5 Discussion

3.6 References

Chapter-4 Adjuvant effects of ECMS on humoral immune responses to FMDV vaccination in heifers Summary

4.1 Introduction

4.2 Materials and methods

4.3 Statistical analysis

4.4 Results

4.5 Discussion

4.6 References

Chapter-5 Improvement of the immune response to FMDV vaccine in calves and lactating cows using ECMS as adjuvant Summary

5.1 Introduction

5.2 Materials and methods

5.3 Statistical analysis

5.4 Results

5.5 Discussion

5.6 References

Chapter-6 Adjuvant effect of ECMS on immune responses to FMDV in lactating cows immunized at acupoint Summary

6.1 Introduction

6.2 Materials and methods

6.3 Statistical analysis

6.4 Results

6.5 Discussion

6.6 References

Chapter-7 The effects of ECMS on immune responses in chicken immunized with avian influenza vaccine (H5N1)Summary

7.1 Introduction

7.2 Materials and methods

7.3 Statistical analysis

7.4 Results

7.5 Discussion

7.6 References

Chapter-8 Adjuvant effect of ECMS on infectious bursal diseases virus (IBDV) vaccine in chicken Summary

8.1 Introduction

8.2 Materials and methods

8.3 Statistical analysis

8.4 Results

8.5 Discussion

8.6 References

Concluding remarks

Future prospects

Acknowledgement

APPENDICES

Annexure-Ⅰ Solutions and reagents recipe

Annexure-Ⅱ Commonly used equipments/instruments

Annexure-Ⅲ Publications

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摘要

疫苗免疫是预防动物传染病的一个重要手段。佐剂是提高疫苗免疫效果的一个重要成分。迄今人们已经发现许多物质具有佐剂活性,但是只有少数被许可在实际中使用。许多具有免疫佐剂活性的物质由于其毒性作用而限制了其实际应用。为了寻找低毒性的高效新佐剂,我们对木鳖子的提取物ECMS在促进体液免疫和细胞免疫方面的佐剂作用进行了研究。木鳖子作为中药使用已经有1000多年的历史。就我们所知,虽然木鳖子的药用价值有许多记载,但其免疫佐剂作用方面的研究却鲜有报导。本研究主要采用醇提法获得木鳖子的提取物ECMS。鲎试验检测表明ECMS的内毒素含量低于0.5内毒素单位(EU)/毫升,排除了实验过程中内毒素对实验结果的干扰。为了探讨ECMS的佐剂活性,本文以小鼠、奶牛和鸡为实验动物,研究ECMS对口蹄疫疫苗、禽流感苗及法氏囊疫苗免疫的佐剂作用。本文还研究了口蹄疫疫苗奶牛后海穴注射的免疫效果。
   选取ICR小鼠为实验动物,研究ECMS以及ECMS与矿物油联合使用对亚洲I型口蹄疫抗原的免疫佐剂作用。试验一,28只ICR小鼠随机分成如下4组:1)口蹄疫亚洲I型病毒抗原+50μg ECMS;2)口蹄疫亚洲I型病毒抗原+200μgECMS;3)口蹄疫亚洲I型病毒抗原+800μg ECMS(n=5);4)口蹄疫亚洲I型病毒抗原组,作为阴性对照。分别在第1,第21天进行两次免疫,并在二免后第15,30和第45天分别采血。二免后两周分别从对照组和200μg ECMS组取四只小鼠进行淋巴细胞增殖试验。结果显示,与对照相比,200μg ECMS组小鼠总抗体水平在各采血时间点均显著得到了提高。二免后第30和第45天,800μg ECMS组小鼠总抗体水平显著高于对照组。50μg ECMS组小鼠总抗体在各采血点均高于对照组,但无统计学差异。在二免后第15和第30天,800μg ECMS组血清IgG1抗体OD值显著高于对照组。其他各组小鼠血清IgG1与对照组比较均无显著性差异。800μg ECMS组和50μg ECMS组血清IgG2a抗体显著高于对照。200μg ECMS组血清IgG2a抗体OD值不同时间检测未发生变化。二免后第15天,800μg ECMS组血清IgG2a抗体显著高于同一时间点其他各组,并且此时200μg ECMS组IgG2a抗体OD值显著高于对照组。二免后第30天,800μg ECMS组血清IgG2a抗体显著高于对照组。而在二免后第45天,IgG2a在各组间未见统计学显著性差异。在二免后第15,30和第45天,800μg ECMS组血清IgG3抗体均高于对照。并且,在二免后15天,800μg ECMS组血清IgG3抗体显著高于其他佐剂免疫组。在50μg ECMS组和200μg ECMS组,血清IgG3抗体显著高于对照。ECMS佐剂组小鼠淋巴细胞经抗原刺激后,其刺激指数与对照组比较具有极显著差异。
   试验二,研究ECMS与油佐剂联合使用的佐剂作用效果。23只小鼠随机分成3组:1)油乳化口蹄疫亚洲I型抗原疫苗,作为对照组;2)油乳化口蹄疫亚洲I型抗原疫苗+200gg ECMS组;3)油乳化口蹄疫亚洲I型抗原疫苗+800μgECMS组。分别在第1,第21天进行两次免疫,并在二免后第15,30和第45天分别采血。二免后三周分别从对照组和200μg ECMS组取四只小鼠进行淋巴细胞增殖试验。结果表明,在二免后第15天和第30天,800μg ECMS组总抗体水平显著高于对照组。IgG1抗体水平方面,各ECMS组均高于对照,但均无显著性差异。二免后第15天,200μg ECMS组小鼠血清IgG3抗体水平显著高于对照。淋巴细胞增殖试验中,ECMS组刺激指数仅在平均值上高于对照,无统计学差异。
   在青年奶牛,犊牛和泌乳奶牛进行ECMS对口蹄疫亚洲I型和O型双价苗佐剂作用研究。
   18头青年奶牛随机分成3组,分别免疫:1)口蹄疫亚洲I型和O型双价油佐商品苗,对照;2)口蹄疫亚洲I型和O型双价油佐商品苗+0.5mg ECMS组;3)口蹄疫亚洲I型和O型双价油佐商品苗+2mg ECMS组。结果为,在免疫后第60天和第90天,2mg ECMS佐剂组间接血凝效价显著高于对照组。免疫后第30天,0.5mg ECMS组血清抗VP1抗体水平显著高于对照组,而2mg ECMS组抗体水平虽高于对照,但并无统计学差异。在免疫后第60天和第90天,2mg ECMS组抗VP1抗体OD值显著高于对照,而O.5mg ECMS组高于对照,但无显著性。在免疫后第30天和第60天,2mg ECMS组血清抗口蹄疫亚洲I型总抗体OD值显著高于对照,而2mg ECMS组血清抗口蹄疫O型总抗体水平在免疫后第60天和90天均显著高于对照。
   12头年青母牛随机分成2组,分别免疫:1)口蹄疫亚洲I型和O型双价油佐商品苗,对照;2)口蹄疫亚洲I型和O型双价油佐商品苗+2mg ECMS组。在免疫前和免疫后第30,60和90天,分别采血,进行间接血凝试验和ELISA检测,以及经亚洲I型,O型抗原刺激和Con-A,PHA刺激的淋巴细胞增殖试验。结果表明,ECMS组在所有采血时间点的间接血凝滴度均显著高于对照组。在免疫后第60和90天,ECMS组血清抗口蹄疫亚洲I型总抗体OD值和抗O型总抗体OD值均显著高于无佐剂组。淋巴细胞增殖试验结果显示,ECMS佐剂组经抗原或Con-A,PHA刺激的刺激指数均显著高于对照。
   14头泌乳奶牛随机分成2组(n=7),分别免疫:1)口蹄疫亚洲I型和O型双价油佐商品苗,对照:2)口蹄疫亚洲I型和O型双价油佐商品苗+2mg ECMS组。在免疫前和免疫后第30,60和90天,分别采血进行抗体检测。在免疫后第60和90天,ECMS组血清IgG抗体OD值显著高于对照(P<0.05或P<0.01)。ECMS组在所有采血时间点血清抗O型抗体OD值均显著高于对照组(P<0.05)。
   另外,还研究了不同穴位免疫口蹄疫双价苗和ECMS佐剂,探讨针灸穴位对ECMS佐剂作用的影响。试验一,3组泌乳奶牛(n=7),分别进行1)颈部肌肉注射2ml口蹄疫亚洲I型和O型双价油佐商品苗,对照;2)颈部肌肉注射2ml口蹄疫亚洲I型和O型双价油佐商品苗+2mg ECMS组;3)后海穴注射2ml口蹄疫亚洲I型和O型双价油佐商品苗+2mg ECMS组。在免疫前和免疫后第30,60,90和120天分别采血,检测抗O型血凝效价。结果显示,在各采血点ECMS组间接血凝效价均显著高于对照组(P<0.05或P<0.01)。后海穴免疫疫苗的ECMS组平均间接血凝效价均高于肌肉注射的ECMS组,但仅在免疫后第120天采集血清的间接血凝效价与肌注相比有显著差异(P<0.05)。外周血分离的淋巴细胞分别经口蹄疫亚洲I型和O型抗原刺激后,ECMS组刺激指数均显著地高于对照组(P<0.05或P<0.01),而穴位注射组刺激指数虽高于ECMS肌肉注射组,但并无显著性差异。
   试验二,1)后海穴免疫1ml口蹄疫双价商品苗,对照组(n=6);2)后海穴免疫1ml口蹄疫双价商品苗+2mg ECMS,为实验组(n=6)。在免疫前和免疫后第30,60和90天分别采血。ECMS佐剂组血清抗亚洲I型口蹄疫总抗体水平在所有采血时间点均高于对照,但仅在免疫后第60天出现显著性差异(P<0.05)。ECMS佐剂组血清抗O型口蹄疫总抗体在所有采血时间点同样高于对照,但仅在免疫后第60和90天出现显著性差异(P<0.05或P<0.01)。免疫后第30天,ECMS组间接血凝效价显著高于对照组血清(P<0.05)。
   在鸡的免疫试验中,研究了ECMS对禽流感抗原的佐剂作用。试验一,60只两周龄雏鸡(n=10)根据如下分组1)禽流感H5N1疫苗对照组;2)禽流感H5N1疫苗+5μg ECMS组;3)禽流感H5N1疫苗+10μg ECMS组;4)禽流感H5N1疫苗+20μg ECMS组;5)禽流感H5N1疫苗+40μg ECMS组;6)禽流感H5N1疫苗+80μg ECMS组。在免疫前和免疫后第7,14和28天分别采血。结果表明,所有ECMS组的总抗体平均OD值都高于对照组,但仅在免疫后第28天的10μg ECMS组和20μg ECMS组与对照相比有统计学差异(P<0.05)。同时,20μg ECMS组的鸡平均日增重显著地高于对照组(P<0.05),指示ECMS的使用不会对日增重产生不良影响。试验二选取50只雏鸡(n=25)进行对照组和20μg ECMS组比较试验,结果同样证实,不同时间点ECMS组血清血凝效价均得到了显著提高(P<0.05)。
   在研究ECMS对传染性法氏囊病病毒(IBDV)的佐剂作用中,52只雏鸡(n=13)分组情况如下1)IBDV疫苗,作为对照组:2)IBDV疫苗+20μg ECMS组;3)IBDV疫苗+40μg ECMS组;4)IBDV疫苗+80μg ECMS组。结果表明,ECMS均能提高总抗体水平,并且在免疫后第14,21,28和35天检测,20μg ECMS组与对照组相比,能显著性提高抗体OD值(P<0.05)。ECMS组淋巴细胞刺激指数也显著高于对照组(P<0.05或P<0.01)。同时,ECMS对鸡各项生长指标均无不利影响,并见有ECMS组鸡平均日增重显著高于对照组(P<0.05或P<0.01)。综合上述研究结果,我们认为,ECMS对牛用口蹄疫疫苗,鸡禽流感疫苗和鸡传染性法氏囊疫苗均具有显著的免疫佐剂作用,提示ECMS可作为佐剂进行进一步的研究和开发。

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