水稻抗病相关RNA解旋酶基因OsBIRH1的功能分析及YTH蛋白基因家族的初步研究

摘要

最近的研究表明，DEAD-box RMA解旋酶和RNA结合蛋白在植物的生长发育、激素应答以及对环境逆境反应中起重要作用。在本实验室前期对水稻诱导抗病性的研究中，通过抑制性差减杂交法得到了两个差别表达克隆，预测分别编码DEAD-box RNA解旋酶蛋白和含YTH结构域的未知蛋白。在本研究中，我们通过生化和遗传学手段研究了水稻DEAD-box RNA解旋酶基因OsBIRHI的功能；同时，我们运用生物信息学方法鉴定了水稻和拟南芥中含YTH结构域的基因家族，并对拟南芥YTH家族成员的生化活性和表达模式进行了初步的研究。 OsBIRHI基因全长cDNA为2108 bp，其中包含1926 bp的ORF，编码一个含642个氨基酸的蛋白，含有DEAD-box RNA解旋酶蛋白所有的特征性保守结构域。基因结构分析表明OsBIRHI基因位于水稻第3染色体上，由8个外显子和7个内含子组成，在水稻基因组中以单拷贝的形式存在。纯化并获得重组OsBIRHI融合蛋白，分析了重组OsBIRHI蛋白的ATPase活性和RNA解旋活性，结果表明OsBIRHI蛋白具有DEAD-box RNA解旋酶的一般特征，即依赖于RNA的ATPase活性和双链RNA解旋酶活性。Northem分析结果表明，OsBIRHI基因在水稻植株体内有一定水平的基础表达，但BTH、SA、ACC和JA等抗病信号分子能诱导OsBIRHI基因的表达，且在水稻幼苗与稻瘟菌(Magnaporthegrisea)非亲和性互作中在接种后6 h时就快速激活表达，而在亲和性互作的感病水稻幼苗中几乎检测不到OsBIRHI的诱导表达。 利用转基因拟南芥植株进行了OsBIRHI的功能分析。将OsBIRHI的编码框序列克隆进含有CaMV35S启动子的载体pCAMBIA99-1，构建了水稻OsBIRHI基因的植物转化双元表达载体。通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的蘸花法将OsBIRHI基因转化拟南芥，Hyg+抗性和PCR筛选获得15株转OsBIRH1基因T1代拟南芥植株。Southern分析表明1～2个拷贝的OsBIRH1基因已整合到拟南芥基因组DNA中。RT-PCR分析结果表明所检测的OsBIRH1转基因烟草T3代单拷贝纯合体植株都能够正常表达。抗病性测定表明，这些转基因植株提高了对Alternaria brassicicola、Pseudomonas syringae pv tomato DC3000的抗病性，这些转基因植株中PR-1、PR-2、PR-5、PDF1.2基因都有组成型增强表达。此外，转OsBIRH1基因植株对干旱胁迫和氧化胁迫都表现出一定的抗性。这些结果表明OsBIRH1编码了一个DEAD-box RNA解旋酶，而且在植物抗病和抗逆方面扮演着重要的角色。 最近，运用生物信息学方法在蛋白数据库中鉴定发现一类非常保守的未知功能蛋白，并且推测这些包含保守结构域YTH的蛋白可能具有RNA结合的活性。为了深入了解这些含YTH结构域蛋白的生物学功能，我们运用生物信息学方法在拟南芥和水稻基因组中分别鉴定了13和12个基因，命名为AtYTH01～13和OsYTH01～12。这些结果表明在高等植物中含有YTH结构域的蛋白组成一个相对较小的基因家族。拟南芥和水稻的YTH家族成员蛋白都包含一个非常保守的YTH结构域，但是在这个结构域外还没有发现其它已知的或者保守的结构域。将AtYTH05和AtYTH07的编码区ORF克隆进原核表达载体，纯化获得重组的蛋白。凝胶阻滞试验的结果发现重组的AtYTH05融合蛋白能够在体外与单链RNA相结合，表明YTH蛋白具有RNA结合活性。同时，我们也用RT-PCR的方法分析了拟南芥YTH家族所有成员的表达模式，结果显示拟南芥YTH家族基因的表达都存在着组织和时空的特异性。我们还克隆了AtYTH05和AtYTH07的启动子，构建Promoter::GUS融合基因并转化拟南芥，GUS染色结果显示这两个基因的表达受开花的强烈诱导，这与RT-PCR的结果相一致。我们的初步研究结果表明，YTH家族是一个新的RNA结合蛋白类群，并且可能在植物的生长和发育上起重要作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录

致谢

第一章文献综述和研究背景

1.1植物的先天免疫系统(innate immunity)

1.2植物的诱导免疫系统(induced immunity)

1.2.1 SAR及其SA信号途径

1.2.2 ISR及其JA/ET信号途径

1.3 DEAD box RNA解旋酶

1.3.1 DEAD-box RNA解旋酶的序列特征与生化活性

1.3.2 DEAD-box蛋白家族成员的细胞功能

1.3.3 DEAD-box RNA解旋酶在植物中的作用

1.4 RNA结合蛋白

1.4.1蛋白质识别的RNA的二级结构单元

1.4.2蛋白质中的RNA结合结构域

1.4.3植物RNA结合蛋白的作用

1.5本研究的目的意义和主要研究内容

第二章水稻抗病相关DEAD-box RNA解旋酶基因OSBIRH1的功能分析

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1供试稻瘟菌菌株与接种

2.2.2水稻幼苗培育与处理

2.2.3 OsBIRH1 cDNA基因的克隆

2.2.4 DNA的序列测定和分析

2.2.5 OsBIRH1融合蛋白的原核表达

2.2.6 OsBIRH1蛋白的体外RNA解旋和RNA结合活性分析

2.2.7 ATPase活性测定

2.2.8植物组织总RNA和基因组DNA的提取

2.2.9 Northern和Southern杂交

2.2.10水稻OsBIRH1基因植物转化双元表达载体的构建

2.2.11拟南芥转化以及转基因植株的筛选鉴定

2.2.12转基因拟南芥植株PR基因的RT-PCR表达分析

2.2.13转OsBIRH1基因拟南芥的抗病性测定

2.2.14转OsBIRH1基因拟南芥对干旱和ABA的反应

2.2.15叶绿素含量的测定

2.3结果与分析

2.3.1 OsBIRH1基因全长cDNA序列的克隆及序列分析

2.3.2 OsBIRH1蛋白的结构与系统进化树分析

2.3.3 OsBIRH1蛋白依赖RNA的ATPase活性

2.3.4 OsBIRH1蛋白的RNA解旋活性

2.3.5 OsBIRH1基因在水稻抗病反应中的差异表达

2.3.6 OsBIRH1基因植物转化双元表达载体的构建

2.3.7转OsBIRH1基因的拟南芥的分子鉴定

2.3.8转OsBIRH1基因拟南芥植株提高了对不同病原菌的抗病性

2.3.9过量表达OsBIRH1基因的转拟南芥植株中PR基因的表达

2.3.10转OsBIRH1基因拟南芥植株提高对ABA的敏感性和干旱的抗性

2.3.11转OsBIRH1基因拟南芥植株提高对氧化胁迫的抗性

2.4.讨论

附图表

第三章拟南芥和水稻YTH结构域RNA结合蛋白家族的初步研究

3.1前言

3.2材料和方法

3.2.1供试拟南芥生长与培育

3.2.2拟南芥和水稻YTH结构域蛋白基因的鉴定

3.2.3 AtYTH05/07融合蛋白的纯化

3.2.4 AtYTH5蛋白的体外RNA结合活性分析

3.2.5 AtYTH05、AtYTH07基因Promoter：：GUS载体的构建

3.2.6拟南芥的转化

3.2.7植物组GUS染色

3.2.8拟南芥突变体纯合体的筛选

3.2.9拟南芥YTH基因的表达分析

3.3结果与分析

3.3.1拟南芥和水稻中YTH家族成员的鉴定

3.3.2拟南芥和水稻中YTH家族蛋白的序列分析

3.3.3 AtYTH5蛋白的RNA结合活性

3.3.4拟南芥YTH家族成员基因的表达分析

3.3.5拟南芥AtYTH05和AtYTH07基因的启动子活性

3.3.6拟南芥YTH家族T-DNA敲除纯合体的筛选鉴定

3.4讨论

附图表

第四章全文小结和今后研究

参考文献