可溶性血管内皮生长因子受体基因转染树突状细胞的抗肺癌转移作用

摘要

一、研究背景 到目前为止，肺癌已成为当今世界男性发病率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌约占80％，诊断确立时仅30％的患者有手术机会，无手术机会的患者预后极差，及时采用放、化疗等综合治疗，大都数患者在5年之内发生肿瘤转移。尽管第三代化疗药物不断涌现，但5年生存率提高极为有限，东部肿瘤协作组(ECOG)将标准的紫杉醇/顺铂方案与其他三种含铂类方案的疗效进行对比，中位生存期、1、2年存活率的差异并无统计学意义。因此，对于非小细胞肺癌的治疗，迫切需要新的方案。生物靶向治疗的出现，给肺癌的治疗带来了新的希望。目前临床常用的肺癌靶向治疗有两个重要靶点，一个是表皮生长因子及受体(EGFR)，另一个是血管内皮生长因子及受体(’VEGFR)，前者主要介导肿瘤细胞的增殖和生长，后者主要介导肿瘤新生血管的形成。有研究证实，肿瘤超过1～2mm3时，其生长必须依赖肿瘤新生血管的形成，抑制肿瘤新生血管的形成能显著抑制肿瘤的增生和转移。目前发现与肿瘤新生血管有关的细胞因子有血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)等，其中血管内皮生长因子是形成新生血管最关键的因子，目前有多种方法如反义核酸技术、单克隆抗体技术、小分子RNA干扰技术、可溶性受体技术等来阻断VEGF与受体的信号转导，抑制肿瘤新生血管的形成，从而抑制肿瘤的生长和转移。树突状细胞(DC)是体内功能最强大的抗原提呈细胞，以DC为基础的抗肿瘤主动免疫成为研究热点，有学者利用DC强大的抗原提呈功能，用于抗肿瘤新生血管形成，结果令人满意。Schmitt用膀胱癌患者肿瘤细胞提取mRNA转染自体DC，与T细胞共培育，CTL应答反应明显上升，抑制肿瘤诱导的新生血管形成，具有显著的抗肿瘤转移作用。本文研究了VEGFR-2胞外区，即可溶性VEGFR-2(sVEGFR)cDNA修饰DC抗肺癌转移作用及其机制。 二、材料与方法 (一)实验材料 1.小鼠、质粒、细胞 2.分子克隆及细胞培养试剂。 (二)实验方法 用Trizol一步法从表达VEGFR-2的小鼠血管内皮细胞系H5V(H-2b)提取总RNA。用First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司产品)将1μg总RNA逆转录成cDNA。PCR扩增sVEGFR-2基因片段，上游引物(P1)：5’-CG GGATCC ATG GAGAGC AAG GCG CTG-3’；下游引物(P2)：5’-G GAATrC TCATTCCAA GTT GGT CTT TTV-3’；目的片段为2304 bp。PCR产物作琼脂糖凝胶电泳鉴定并将片段切下胶回收，T-A克隆构建pMD18-T/sVEGFR-2，T-A克隆产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，小量抽提pMD18-T/sVEGFR-2重组质粒，对抽提的质粒进行BamHI-EcoRI双酶切鉴定，对酶切鉴定正确的质粒进行测序，经测序正确的pMD18-T/sVEGFR-2质粒和pcDNA3.1(+)空载体质粒分别以BamHI和EcoRI双酶切，酶切产物分别作琼脂糖凝胶电泳，将sVEGFR-2目的片段与pcDNA3.1(+)载体大片段分别切下胶回收。将胶回收sVEGFR-2目的片段与胶回收表达载体pcDNA3.1(+)作连接反应，连接产物全部转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，37℃培养16-20h后挑选单个菌落若干扩增，小量抽提pcDNA3.1(+)/sVEGFR-2重组质粒，BamHI和EcoRI双酶切鉴定，阳性质粒为构建成功的pcDNA3.1(+)/sVEGFR．2质粒；取C57BL/6小鼠骨髓，处理后将骨髓细胞配成2x106/ml，于6孔板上，每孔加3ml，在37℃、5％CO2条件下培养，完成DC的制备；将构建成功的pcDNA3.1(+)/sVEGFR-2质粒用电穿孔法基因转染DC：酶联免疫吸附(ELISA)法测定sVEGFR-2的表达；将转染后DC免疫小鼠：将C57BL/6小鼠分为4组，经尾静脉分别给小鼠注射PBS、DC、pcDNA3.1修饰的DC(DC．vector)和pcDNA3.1/sVEGFR-2修饰的DC(DC-sVEGFR-2)，每只小鼠注射剂量为100μl，连续3次，每次间隔1周；第3次免疫注射后10天，给小鼠后腿足垫内注射3LL Lewis肺癌细胞(2×105细胞/鼠，每组8～10只小鼠)，当肿瘤直径达到6mm时，截去荷瘤小腿。当对照组荷瘤小鼠开始死亡时，处死各组小鼠，计数肺表面肿瘤转移灶数目。 三、结果 (1)PCR产物为2304bp，包括含信号肽序列的三sVEGFR-2cDNA(208～2493bp)，BamH I(5’)和EcoR I(3’)两个酶切位点以及人为加上的终止密码。 (2)sVEGFR-2 cDNA测序结果(5’端)，与标准序列一致。 (3)5个不同克隆的pcDNA3.1(+)/sVEGFR-2 BamHI和EcoRI双酶切结果均得到目的片段和载体片段，表明目的片段已成功插入到BamHI和EcoRI酶切位点之间，所构建的质粒正确。 (4)用电穿孔法将pcDNA3.1/GFP转染DC，转染效率为71％。经sVEGFR-2转染的DC可有效表达sVEGFR-2，而DC-vector和DC不表达sVEGFR-2，统计学有非常显著差异(P<0.01.)。 (5)经DC-sVEGFR-2免疫的小鼠肺转移灶数目明显减少，与对照组相比，差异有非常显著的意义。 四、讨论 新生血管的生成是肺癌生长和转移的基础，如果没有肿瘤新生血管提供营养和氧气，肿瘤长到1～2mm3就会停止生长。血管内皮生长因子及受体是重要的血管生成正性调节因子，与肺癌增殖和转移有着十分密切的关系。血管内皮生长因子及其受体是目前肺癌靶向治疗的重要靶点。树突状细胞是体内专职的抗原提呈细胞，具有独特的刺激T细胞增殖的能力，是机体免疫应答的始动因素，是一种天然的免疫佐剂。应用sVEGFR-2基因转染的树突状细胞疫苗，能高水平地表达sVEGFR-2，中和VEGF，打断VEGF/VEGFR的信号转导途径，抑制肿瘤新生血管形成；此外，还去除了VEGF对树突状细胞的抑制，提高树突状细胞数量和质量，提高机体的免疫应答水平。经sVEGFR-2基因转染的树突状细胞疫苗，还可以诱导机体针对VEGFR的特异性免疫应答，直接杀伤新生血管的内皮细胞，强烈抑制新生血管的生成，从而肿瘤的生长和转移。从本研究结果分析，由于3LL Lewi s肺癌细胞本身不表达VEGFR-2，经DC-sVEGFR-2免疫的小鼠抗肺癌细胞转移并不是对肺癌细胞的直接杀伤，进一步说明新生血管形成在肿瘤生长和转移中的作用。由于血管内皮细胞具有遗传稳定性，以此为靶点可以减少耐药性的产生，具有一定优势。但由于制备复杂及临床相关安全性问题，DC-sVEGFR-2运用于临床，尚有许多亟待解决的问题。 五、结论 1、DC-sVEGFR-2能有效表达sVEGFR-2，而DC-vector和DC不表达sVEGFR-2。 2、DC-sVEGFR-2免疫显著抑制实验性肺肿瘤的转移。

目录

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述:VEGF/VEFR在肺癌生物靶向治疗中的研究进展

致谢