大熊猫主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ类基因的研究

摘要

大熊猫是我国特有的Ⅰ级濒危野生动物,被称为“国宝”,倍受世界瞩目。历史上它曾经在我国有广泛的分布,但是受冰期和人类活动的影响,大熊猫的生境越来越破碎化,到现在仅分布于秦岭、岷山、邛崃、凉山、大相岭和小相岭六个山系中,其中秦岭种群已经分化成了大熊猫的一个亚种--秦岭亚种(Ailuropoda m.qinlingensis)。 作为濒危动物离体保护的重要内容之一,我们构建了大熊猫的基因组BAC文库,以保存大熊猫的珍贵的遗传资源,同时为后面开展大熊猫的比较基因组学、基因功能研究打下基础。主要组织相容性复合体(MHC)是具有抗原呈递功能的免疫基因家族,其I类和II类基因具有重要的适应性意义,被应用于种群抗病能力的研究。本研究成功地分离出了三个大熊猫的MHC I类基因。主要结果如下： ·以大熊猫“成功”的新鲜外周血液为材料,成功地构建了大熊猫的基因组文库,共包含205 800个克隆,保存于2100块96孔培养板上。对随机挑取的174个BAC克隆进行酶切和大小检测,计算出文库的平均插入片段为97kb,空载体率为5.74％。参照黑熊和喜马拉雅黑熊的基因组大小,本文库的基因组覆盖率为6.8倍,获得单拷贝基因的概率是99.93％。16对引物检测文库阳性克隆的数目范围为2～16,平均每对引物的阳性克隆数为6.2。 ·我们采用4D PCR的方法,从文库中筛选出目的基因。我们将文库分成43个超级库和1462(43×34)个1D、2D、3D、4D超级亚库。每对引物首先通过43个PCR反应确定阳性克隆所在的超级库,然后只需要7+7+8+12=77个PCR反应,就能从超级亚库中筛选到所需的阳性BAC克隆。 ·本研究从大熊猫mRNA和基因组BAC文库克隆了三个MHCI类基因,分别定名为Aime-128、Aime-152和Aime-1906。基因结构、蛋白质结构预测、启动子分析、系统进化树分析都表明,这三个基因属于MHC I类基因家族。 ·Aime-1906是大熊猫非常特殊的一个非经典的I类基因,体现在： i.Aime-1906在外显子7的起始区域含有一个提前的终止子,使得该基因具有缩短的细胞质尾链。分析Aime-1906基因外显子2和3里面哺乳动物Ia基因都保守的十个氨基酸时,发现只有五处是保守的； ii.外显子2和3的编码子第三个碱基的GC含量分布显示,Aime-1906比Aime-128和Aime-152都要低,显示出它更倾向于是1b基因； Ⅲ.外显子2和3的氨基酸变异显示,只有约1/3的氨基酸变异是位于抗原结合区域的,与经典的I类基因情况不符； iv.系统进化树分析表明,Aime-1906与DLA-79亲缘关系更近,显示出它们可能有着共同的起源关系,与大熊猫和其它食肉目动物的I类基因处于完全隔开的进化枝上,推测该基因可能有着与其它大熊猫的I类基因不-样的进化历史。 ·Aime-128,Aime-152是属于大熊猫I类基因的两个位点,体现在： i.基因序列:Aime-128、Aime-152的5’UTR、3’UTR和exon 1都呈现出很大的差异性,序列相似度分别为84％、87％和88％。上游启动子序列分析表明,Aime-128、Aime-152在核心元件enhancer A和W/S都有较大的差异。比较Ia抗原结合区保守的十个氨基酸,Aime-152存在两个常规的氨基酸改变,L5和R146; ii.GC含量检测:Aime-152抗原结合区域和非抗原结合区域编码子的第三个碱基的GC含量值比Aime-128要小； Ⅲ.系统进化树分析:Aime-128、Aime-152在用exon2-3构建的食肉目系统进化树里面,都形成了单独的进化枝。进化关系显示,大熊猫基因组上还存在着比Aime-152更接近于Aime-128的I类位点； ·本研究所获得的大熊猫的I类基因外显子2和3等位基因抗原结合区域的无义突变和有义突变的置换率(ds、dn)计算都显示dn远大于ds,表明了大熊猫的I类基因也存在着强的平衡选择； ·本研究显示,大熊猫的I类基因与其它哺乳动物的I类基因特征相似,是具有多个位点的复杂的基因家族。

目录

声明

内容提要

英文提要

第一部分 文献综述

第一章大熊猫研究综述

第一节大熊猫的形态和分布

第二节大熊猫分子生物学研究概况

第二章 基因组BAC文库构建

第一节基因组文库与保护遗传学的关系

第二节基因组文库构建的发展概述

第三章主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类基因的研究概括

1.1类分子的结构

2.1类基因的分类

3.脊椎动物MHC Ⅰ类基因的克隆概况

4.1类基因启动子区域的研究

5.1类基因的进化和功能研究的意义

第四章本研究的立项依据、目的和内容

第二部分 大熊猫基因组BAC文库的构建

第五章材料和方法

第一节材料

第二节方法

第六章实验结果和讨论

第一节实验结果

第二节实验数据分析和讨论

第三部分 MHCⅠ类基因的研究

第七章材料和方法

第一节材料

第二节方法

第八章 Ⅰ类基因克隆的结果和讨论

第一节实验结果

第二节实验数据分析

第三节讨论

第四部分 本研究主要结论和创新

第九章本研究主要结论和创新

第一节本研究的主要结论

第二节创新之处

第十章参考文献

第十一章攻读博士学位论文期间参与的研究工作

附录Ⅰ 攻读博士学位期间撰写的论文

致 谢