抵抗素在糖尿病和冠心病中的作用及其可能的分子机制

摘要

抵抗素是一种新近发现的富含半胱氨酸的脂肪内分泌因子，在啮齿类动物，抵抗素可以引起胰岛素抵抗，与肥胖和糖尿病等有明显的相关性，但人类抵抗素在这些疾病中的作用尚不明确。本研究旨在观察糖尿病，糖尿病合并冠心病及冠心病不同类型之间的血清抵抗素水平，明确其在此类疾病中的作用。并在此基础上，对抵抗素在细胞内可能的作用靶点进行初步探讨。 材料和方法: 1.研究对象 在2型糖尿病(T2DM)、T2DM合并冠心病(CAD)与抵抗素的关系研究中，取T2DM患者40例、T2DM合并CAD患者38例、健康对照组34例。而在观察不同类型冠心病患者血清抵抗素水平的变化时，26例健康人群和65例冠心病患者入选，其中急性心肌梗死(AMD 24例、不稳定性心绞痛(UAP)19例、稳定性心绞痛(SAP)22例。 2.材料和方法酶联免疫吸附法测定血清抵抗素水平，白细胞计数(WBC)；超敏C反应蛋白(hsCRP)；心肌肌酸激酶(CK)；心肌肌酸激酶同工酶(CK-MB)；肌钙蛋白(cTnI)等用常规实验方法测定。 构建真核表达载体pSecTag2B-RETN，pSeclRP-LUC，pSec-LUC，pSecO-LUC质粒。pSecTag2B-RETN质粒稳定转染L02细胞，用Western blowing检测抵抗素融合蛋白的表达。免疫荧光明确抵抗素在细胞中的定位。把含荧光素酶报告基因的质粒pSecIRP-LUC，pSec-LUC，pSecO-LUC瞬时转染HepG2细胞，重组人抵抗素处理后，测定荧光素酶的活性。观察抵抗素对胰岛素受体表达的调控作用。 结果: 1.抵抗素与T2DM、T2DM合并CADT2DM和T2DM合并CAD组血清抵抗素水平均明显高于对照组；T2DM合并CAD组血清抵抗素比T2DM组高。 2.抵抗素与AMI、UAP和SAPAMI、UAP和SAP各组血清抵抗素水平与对照组相比均明显增高(P<0.05)。另外，AMI组中血清抵抗素水平高于UAP和SAP组。同时发现UAP和SAP组之间存在着明显的统计学差异。在AMI组，血清抵抗素水平与WBC、hsCRP和CKmax、CK-MBmax、cTnImax正相关(相关系数分别为0.412、0.427、0.731、0.678、0.656)。 3.抵抗素在细胞中的定位和对胰岛素受体表达的调控经Western blot证实，抵抗素融合蛋白表达成功。免疫荧光激光共聚焦显微镜观察，绿色荧光集中在细胞核，提示抵抗素的作用靶点可能在细胞核。含胰岛素受体启动子的报告基因质粒转染HepG2细胞，重组抵抗素蛋白处理后荧光素酶活性与处理前相比无显著性差异。 结论: 1.T2DM、T2DM合并CAD患者血清抵抗素明显增高，推测抵抗素可能参与了胰岛素抵抗及动脉粥样硬化的进程。 2.血清抵抗素水平与心肌损害大小及炎症标志物有关，随着病情的进展、心肌损害的加重，血清抵抗素水平呈增高趋势，提示血清抵抗素可能作为炎症因子参与了动脉粥样硬化和急性心肌梗死的发生、发展。 3.抵抗素在细胞水平的定位研究，发现抵抗素蛋白主要积聚在细胞核中，提示其作用靶点可能在细胞核。 4.含胰岛素受体启动子的荧光素酶报告基因活性不受抵抗素的影响，提示：胰岛素受体在DNA水平不受抵抗素的调控。

目录

前言

材料与方法

1.研究对象

1.1糖尿病、糖尿病合并冠心病

1.2冠心病

2.标本采集

3.试剂和仪器

4.血清抵抗素含量检测

5.质粒构建

6.抵抗素蛋白的真核表达

6.1 Zeocin筛选LO2细胞的浓度测定

6.2 pSecTag2B-RETN质粒稳定转染

7.Western Blotting

8.免疫荧光

8.1 L02-T细胞免疫荧光

8.2其他细胞免疫荧光

9.荧光素酶报告基因检测

9.1瞬时转染

9.2荧光素酶活性检测

10.统计学处理

结果

1.抵抗素与糖尿病、糖尿病合并冠心病

1.1对照组血清抵抗素水平

1.2 T2DM和T2DM合并CAD组患者血清抵抗素水平

2.抵抗素与AMI、UAP、SAP

2.1 AMI、UAP、SAP和对照组血清抵抗素水平

2.2抵抗素与WBC、hsCRP、CKmax、CK-MBmax、cTnIma相关分析

3.质粒构建

4.抵抗素融合蛋白表达

5.抵抗素的细胞内靶位

6.抵抗素对胰岛素受体表达的调控作用

讨论

一、抵抗素与糖尿病、糖尿病合并冠心病

二、抵抗素与冠心病

三、抵抗素在细胞水平的作用

结论

参考文献

抵抗素的研究进展

致谢

发表论文清单