血管生成素作用机制探索——血管生成素与卵泡抑素的相互作用——血管生成素与rDNA的结合及其对rDNA组蛋白修饰的影响

摘要

血管生成素(angiogenin，ANG)是从结肠癌细胞HT-29培养基中分离纯化的生长因子，因其强有力的促血管生成能力而得名。研究表明血管生成素与多种肿瘤的发生、发展及恶化密切相关。目前，对血管生成素生物学功能的作用机制已有一定的了解，证实血管生成素可以通过激活血管生成必需的多个步骤而促进肿瘤新血管的形成和肿瘤的发生，包括1)血管生成素可与内皮细胞表面的肌动蛋白结合，从而激活细胞外周的蛋白酶，降解基底膜和胞外基质，促进细胞的迁移和侵入其他组织的能力；2)可介导细胞粘着；3)通过激活内皮细胞Erk1／2及PKB／Akt通路和平滑肌细胞JNK／SAPK信号传导途径从而刺激细胞分裂、分化；4)胞外血管生成素可经核转位直接进入内皮细胞和平滑肌细胞的细胞核，并最后积聚在核仁区促进核糖体RNA(rRNA)基因的转录；5)最近的研究表明，除了内皮细胞、平滑肌细胞外，血管生成素还可经核转位进入HeLa和PC-3等肿瘤细胞的核仁区，促进rRNA转录和核糖体的形成、直接刺激肿瘤细胞的增殖和肿瘤生成。 基于蛋白质相互作用在生命活动中扮演的重要角色，推测关键蛋白质的相互作用必定介导或调节血管生成素促进的肿瘤血管生成及肿瘤细胞增殖等生物学过程，但是目前对血管生成素相互作用蛋白质的了解较贫乏。为探索血管生成素功能活动中的蛋白质相互作用情况，本实验室曾用酵母双杂交技术对人心肌cDNA文库和肝cDNA文库进行了筛选，获得了21个可能与血管生成素相互作用的候选蛋白质，其中包括在细胞分泌、增殖、凋亡等过程起重要调节作用的卵泡抑素(Follistatin，FS)。 第一部分：血管生成素与卵泡抑素的相互作用 为确证血管生成素与卵泡抑素间的相互作用的真实性，首先利用体外蛋白沉降实验对血管生成素与卵泡抑素的相互作用进行了验证。在大肠杆菌中表达带组氨酸标签的卵泡抑素后，将之与血管生成素蛋白在体外反应体系中孵育，然后用Ni珠沉降带组氨酸标签的卵泡抑素，最后用Western Blot方法检测沉降复合物中是否存在血管生成素。结果显示血管生成素可同时被Ni珠沉降下来，表明在体外系统中血管生成素可与卵泡抑素直接结合。 随后我们研究了血管生成素与卵泡抑素在细胞环境下的相互作用。首先构建了分别标记有蓝绿色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)标签的卵泡抑素和血管生成素的真核表达质粒，转染至HeLa细胞，激光共聚焦显微镜下观察他们的定位情况。结果显示两融合蛋白在HeLa细胞中单独表达时均匀分布于细胞核内，共表达后两蛋白呈颗粒状共定位于细胞核内的特定部位，说明两者在细胞环境中有相互作用，且相互作用使各自的细胞内定位发生了改变。荧光共振能量转移(FRET)实验进一步证实了血管生成素与卵泡抑素在HeLa细胞核内的相互作用。在确证卵泡抑素与血管生成素的相互作用后，我们进一步研究了卵泡抑素上与血管生成素的作用位点。成熟的卵泡抑素蛋白包含N端结构域和随后的三个结构非常相似的FS1、FS2和FS3结构域。我们通过PCR扩增得到各种卵泡抑素的缺失突变体基因，在酵母双杂交系统中检测各突变体与血管生成素是否有相互作用。结果显示，卵泡抑素的FS2和FS3结构域共同介导了卵泡抑素与血管生成素的相互作用。 卵泡抑素一直被认为是一个分泌蛋白质，其核定位现象是本研究的一个创新性发现。为进一步研究产生该现象的机制，本论文采用CFP为荧光标签，以直观地观察蛋白在细胞内的定位情况；同时收集细胞培养基上清，Western Blot方法检测蛋白质的分泌情况。为研究生理情况下即带信号肽的卵泡抑素合成后在细胞内的定位情况，首先将带有信号肽的FS基因与CFP基因融合并在HeLa细胞中表达，结果显示，卵泡抑素一部分经分泌途径分泌至细胞外，另一部分则定位于细胞核内。我们知道，一些蛋白的翻译可以从不同位置的甲硫氨酸开始，从而导致所产生的蛋白质不同的细胞内定位。对卵泡抑素氨基酸序列分析显示其前端信号肽中有2个甲硫氨酸，分别位于-29位和-8位。将两个甲硫氨酸分别突变后HeLa细胞内表达结果表明，-29位甲硫氨酸突变后，卵泡抑素不能分泌出细胞，全部定位于细胞核内；而-8位甲硫氨酸突变后，蛋白则全部经分泌途径分泌至细胞外。可见，卵泡抑素可从其信号肽中的不同甲硫氨酸开始翻译，导致蛋白细胞内的不同定位。随后我们对-29位突变体与血管生成素的相互作用进行了共定位和FRET研究。结果显示，两蛋白呈颗粒状共定位于细胞核内的特定部位，FRET实验则再次证实了两蛋白的核内相互作用。以上结果清楚表明，从-8位甲硫氨酸开始翻译的卵泡抑素进入细胞核内，并与核内的血管生成素发生相互作用。为确定卵泡抑素蛋白核定位序列，用PCR技术扩增得到多个卵泡抑素的缺失突变体，将这些突变体基因与CFP基因融合并在HeLa细胞中表达，激光共聚焦显微镜下观察各融合蛋白的细胞内定位情况。结果表明，卵泡抑素的FS1结构域N端的64-100位氨基酸在卵泡抑素进核过程中发挥重要作用。 随后对卵泡抑素与血管生成素相互作用的生物学意义进行了研究。已知血管生成素可与ABE序列结合并促进ABE的启动子活性。卵泡抑素与血管生成素的核内相互作用使我们有理由推测卵泡抑素可能对血管生成素的促转录活性有调节能力。为此，本论文利用ABE-荧光素酶报告系统对该推测进行了验证。结果表明，ABE序列在检测启动子活性的质粒pGL3E中表现出启动子活性，荧光素酶表达量约为pGL3E空质粒组的3.14倍；同时表达血管生成素后，荧光素酶表达量显著升高，约为pGL3E空质粒组的8.02倍，说明血管生成素可促进ABE的启动子活性；卵泡抑素的表达对ABE的启动子活性没有显著影响(约为pGL3E空质粒组的3.76倍)；但当卵泡抑素和血管生成素共表达时，荧光素酶表达量显著降低，约为pGL3E空质粒组的2.69倍，与血管生成素单独表达组相比有显著性差异(t检验，P<0.05)，说明卵泡抑素与血管生成素的相互作用抑制了血管生成素的促ABE转录活性。 第二部分：血管生成素与rDNA的结合及其对rDNA区组蛋白修饰的影响 为探索确定血管生成素的体内rRNA基因(rDNA)区的结合序列，我们利用染色质免疫沉淀技术(ChIP)研究了血管生成素与rDNA各段区域的结合程度。本文首先利用血管生成素的兔多克隆抗体对HeLa细胞的核裂解液进行染色质免疫沉淀实验，以未加抗体沉降组为对照。然后以染色质免疫沉淀的产物为模板，用SYBR Green荧光定量PCR法针对rDNA各段(启动子区、18S区、28S区、ABE区、基因间区)进行扩增，以确定实验组和对照组染色质免疫沉淀产物中rDNA各段含量的比值，这个比值即间接反应了血管生成素与rDNA的结合程度。结果显示，用血管生成素抗体免疫沉淀得到的DNA中，rDNA各段含量与对照组相比均有2-3倍左右的升高，表明血管生成素与rDNA各段均有不同程度结合。随后我们进一步研究了用血管生成素处理前后HeLa细胞中血管生成素与rDNA各段的结合程度的变化。我们将HeLa细胞分为两组，一组外加血管生成素处理，另一组未处理为对照，两组用等量血管生成素抗体进行染色质免疫沉淀实验，荧光定量PCR法检测两组染色质免疫沉淀产物中rDNA各段的含量的比值。结果表明，与未处理组相比，血管生成素处理后其与rDNA各段的结合均有4倍左右的升高，从而进一步证明了血管生成素与rDNA的结合。 随后我们对血管生成素与rDNA整段结合的意义进行了探讨。已有研究表明，许多rRNA转录调节因子都可通过影响rDNA不同区域组蛋白乙酰化和／或甲基化的程度，从而调节rRNA的转录。另外一些与rDNA整段结合的转录因子，如UBF也具有调节染色质结构的作用。因此，我们推测血管生成素与整段rDNA的结合也可能影响染色质的结构。我们仍然运用染色质免疫沉淀法，研究了血管生成素对rDNA区各段组蛋白H4乙酰化程度及H3第9位赖氨酸(H3K9)二甲基化程度的影响。首先我们构建了表达血管生成素mRNA反义链的HeLa细胞稳定转染株(转染空载体为对照)，从而抑制内源血管生成素的表达。然后分别用乙酰化H4抗体和H3K9二甲基化抗体对血管生成素抑制组与对照组进行染色质免疫沉淀，荧光定量PCR法测定两组染色质免疫沉淀产物中rDNA各段含量的比值，该比值即反应了rDNA各段H4乙酰化和H3甲基化程度的改变。结果表明，抑制血管生成素蛋白表达的HeLa细胞株rDNA各段H4乙酰化程度均减低，为对照组的0.5倍左右；rDNA各段H3K9二甲基化程度均有轻弱的升高，约为对照组的1.2-1.7倍不等。H4的乙酰化可促进常染色质的形成和转录的进行，而H3K9二甲基化作用则相反。因此我们推测血管生成素可能通过促进H4乙酰化、减弱H3K9二甲基化程度而改变染色质结构，从而促进rRNA转录。 基于以上两部分研究结果，我们得出如下结论： 1.从信号肽上的第二个AUG开始翻译的卵泡抑素进入细胞核内，与核内的血管生成素相互作用。 2.卵泡抑素FS1结构域的N端64-100位氨基酸介导了其进核过程；而FS2和FS3结构域介导了其与血管生成素的相互作用。 3.核内卵泡抑素通过与血管生成素的相互作用而抑制后者促ABE转录的活性。 4.血管生成素在体内可与整段rDNA结合，引起rDNA区组蛋白修饰改变，即促进组蛋白H4乙酰化程度和轻度减弱组蛋白H3K9二甲基化程度。

目录

论文说明：缩略语

前言

主要仪器设备、材料与试剂

第一部分血管生成素与卵泡抑素的相互作用

导言

原理和技术路线

第1节血管生成素与卵泡抑素相互作用于细胞核内

实验方法

结果

第2节卵泡抑素进核机制研究

实验方法

结果

第3节卵泡抑素抑制血管生成素促ABE转录活性

实验方法

结果

讨论

第二部分血管生成素与rDNA的结合及其对rDNA区组蛋白修饰的影响

导言

原理和技术路线

第1节血管生成素与rDNA区域结合分析

实验方法

结果

第2节血管生成素对rDNA区组蛋白乙酰化及甲基化程度的影响

实验方法

结果

讨论

结论

参考文献：

综述一：血管生成素研究进展

综述二：荧光共振能量转移技术在蛋白质研究中的应用

附录：攻读博士期间发表文章

致谢

补充材料