Klebsiella oxytoca ZU-03发酵生产2，3-丁二醇的研究

摘要

2，3-丁二醇是一种重要的化工原料及燃料，应用前景广泛。利用丰富而且廉价的木质纤维资源代替有限的粮食原料发酵生产2，3-丁二醇，在开发新能源和环境保护等方面具有重要的经济效益和社会效益。本文对一株克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca ZU-03)发酵生产2，3-丁二醇主要工艺参数、半纤维素水解液的主要成分木糖的发酵、玉米芯的预处理和酶解工艺、菌种的驯化及对纤维素水解液发酵等技术进行了研究。 Klebsiella oxytoca ZU-03发酵生产2，3-丁二醇的基础研究结果表明：适宜的发酵参数为初始葡萄糖浓度160g/L，玉米浆浓度6g/L，接种量10％(V/V)，装液量为50mL(250mL，摇瓶)，转速150rpm，pH值6.5，发酵温度30℃。在此优化条件下，葡萄糖利用率可达98％，2,3-丁二醇浓度为74.2g/L，质量转化率为0.46g/g，达到理论值的92％。 木糖是木质纤维原料水解产物中含量仅次于葡萄糖的一种单糖，由半纤维素水解生产，含量可达植物纤维水解糖类的35％以上。传统的酒精酵母等微生物只能利用葡萄糖，而不能利用木糖，对于半纤维素的利用一直是国内外关注的热点之一。研究发现Klebsiella oxytoca ZU-03可以木糖发酵生产2,3-丁二醇。在初始木糖浓度90g/L,玉米浆浓度6g/L，接种量10％(V/V)，pH值5.5，发酵温度30℃的条件下，木糖利用率可达89％，2,3-丁二醇浓度为36.2/L，质量转化率为0.40/g，达到理论值的80％。Klebsiella oxytoca ZU-03对乙酸比较敏感，乙酸的质量浓度增至2g/L时，发酵木糖基本停止。添加适量的葡萄糖可促进Klebsiella oxytoca ZU-03对木糖的发酵。在50g/L木糖与80g/L葡萄糖共发酵，96 h内木糖利用率从以木糖为唯一碳源时的87.0％提高到96.6％。 分别用稀酸和氢氧化钠预处理纤维原料。稀酸预处理后半纤维素的脱除率达到87.5％，而木质素的脱除率仅为6.3％，预处理后的半纤维素水解液里含有较高浓度的发酵抑制物乙酸和糠醛，对后续发酵十分不利；经氢氧化钠预处理后半纤维素的脱除率仅为33.5％，而对木质素的脱除率达到73.9％，预处理后保留了大部分半纤维素，由于葡萄糖和木糖均可以被Klebsiella oxytoca ZU-03利用，发酵生产2，3-丁二醇，因此氢氧化钠预处理更有优势。采用里氏木霉纤维素酶水解上述两种不同方法预处理后的玉米芯纤维残渣，48h后，酶解得率分别为84.5％和81.2％，还原糖的质量浓度分别为61.9 g/L和76.2g/L，综合考虑，选取氢氧化钠预处理方法。采用分批补料酶解工艺，分别在酶解后的12 h和24 h分两次补料，使底物最终质量浓度增加到200g/L，酶解60 h后还原糖质量浓度达到121.8 g/L。探讨了水解液中的有害成分对Klebsiella oxytoca ZU-03发酵生产2，3-丁二醇的影响。实验结果表明水解液中主要的发酵抑制物为高浓度的盐。采用逐步提高培养基中水解液浓度的方法对Klebsiella oxytoca ZU-03进行驯化，提高了其对水解液中菌体发酵抑制物的耐受力。经过12代的驯化，Klebsiella oxytoca ZU-03在水解液中顺利生长并发酵生成2，3-丁二醇，这为水解液预处理方法的简化打下了良好的基础。 利用驯化后的Klebsiella oxytoca ZU-03发酵糖浓度为121.8 g/L(其中葡萄糖浓度为76.8 g/L，木糖浓度为45 g/L)的玉米芯酶解液，pH值调为6.0，发酵108h，葡萄糖利用率为98％，木糖利用率为96％，2，3-丁二醇的浓度为55.4 g/L，质量转化率为0.45，达到理论值的90％。 利用纤维素、半纤维素水解液替代粮食发酵生产2，3-丁二醇具有重要的经济和社会意义，目前国内对这方面的研究尚属空白。本文利用驯化后的Klebsiella oxytoca ZU-03发酵玉米芯水解液生产2，3-丁二醇质量转化率达到理论值得90％，为进一步工业化生产奠定了坚实的基础，对于促进可再生木质纤维素资源的转化利用具有重要价值。

目录

文摘

英文文摘

文献综述

1.1 2，3-丁二醇的应用

1.1.1燃料及燃料添加剂

1.1.2生产甲乙酮

1.1.3生产1，3-丁二烯

1.1.4形成聚酯和聚氨酯的前体

1.1.5其他方面

1.2传统2，3-丁二醇的生产

1.3以木质纤维素酶解液为底物的2，3-丁二醇生产

1.3.1木质纤维素原料

1.3.2纤维原料的预处理

1.3.3纤维原料的酶解

1.4发酵工艺

1.4.1 pH值对发酵过程的影响

1.4.2温度对发酵过程的影响

1.4.3溶氧对发酵过程的影响

1.4.4添加因子对发酵过程的影响

1.4.5培养方式对发酵过程的影响

1.5产物提纯

1.6国内目前研究现状

1.7展望

第二章Klebsiella oxytoca ZU-03发酵生产2，3-丁二醇的基础研究

2.1材料和方法

2.1.1主要仪器与试剂

2.1.2菌种

2.1.3培养基

2.1.4实验方法

2.1.5分析方法

2.2结果与讨论

2.2.1氮源的影响

2.2.2初始pH值的影响

2.2.3温度的影响

2.2.4溶氧量的影响

2.2.5接种量的影响

2.2.6金属离子的影响

2.2.7初始葡萄糖浓度的影响

2.2.8 Klebsiella oxytoca ZU-03发酵生产2，3-丁二醇的时间进程

2.3 小结

第三章Klebsiella oxytoca ZU-03发酵木糖生产2，3-丁二醇的研究

3.1材料和方法

3.1.1菌种

3.1.2培养基

3.1.3发酵条件

3.1.4分析方法

3.2结果与讨论

3.2.1木糖浓度的影响

3.2.2 pH值的影响

3.2.3乙酸的影响

3.2.4 Klebsiella oxytoca ZU-03发酵木糖生产2,3-丁二醇的时间进程

3.2.5 Klebsiella oxytoca ZU-03发酵木糖与葡萄糖的比较

3.2.6葡萄糖添加量的影响

3.2.7 Klebsiella oxytoca ZU-03共发酵葡萄糖和木糖的时间进程

3.3小结

第四章玉米芯的预处理及酶解

4.1材料与方法

4.1.1纤维原料

4.1.2预处理

4.1.3酶制剂

4.1.4酶水解

4.1.5分析方法

4.2结果与讨论

4.2.1稀酸预处理

4.2.2氢氧化钠预处理

4.2.3两种预处理方法的比较

4.2.4分批补料酶解工艺

4.3本章小结

第五章Klebsiella oxytoca ZU-03发酵玉米芯酶解液生产2，3-丁二醇

5.1材料与方法

5.1.1纤维原料及预处理

5.1.2酶制剂

5.1.3菌种及保藏

5.1.4培养基

5.1.5 2，3-丁二醇的发酵

5.1.6菌种驯化

5.1.7分析方法

5.2实验结果与讨论

5.2.1水解液中的有害物质分析

5.2.2菌种的驯化结果

5.2.3 Klebsiella oxytoca ZU-03发酵水解液生产2，3-丁二醇

5.2.4 Klebsiella oxytoca ZU-03发酵玉米芯水解液生产2，3-丁二醇的时间进程

5.3小结

第六章结论与建议

6.1结论

6.2建议

参考文献

致 谢

附录：论文发表情况