几种内分泌干扰物的对映体选择性毒性及其降解

摘要

手性污染物所引发的环境行为和生态安全效应的对映体选择性已经引起人们越来越多的关注，但是对映体标样制备的困难和对映体环境安全评价模型的缺乏限制了该领域研究的发展，而这正是本论文研究所要攻克的难点。在本研究中，我们选择了目前在我国广泛使用的手性农药三氯杀虫酯(AF)和高效氯氟氰菊酯(LCT)做为研究对象，首先建立了它们在高效液相色谱(HPLC)上的手性分离条件。在得到对映体制备小样的基础上，系统研究了它们在发育毒性、内分泌干扰以及免疫毒性上的对映体选择性及机理。同时以环境雌激素17β-雌二醇(E2)为研究对象，研究了它在土壤中的环境行为和非生物氧化降解机理；并采用合成MnO2对一系列甾体类雌激素进行了氧化降解研究；此外还研究了土壤中加入草木灰后，异恶草松对稗草生长抑制的影响。具体研究分述如下： 利用手性固定性在HPLC上对AF和LCT进行了对映体分离。通过条件优化，这两个手性农药在几类手性柱上(Chiralpak AD，Chiralpak AS，Chiralcel OD，Chiralcel OJ和Sumichiral OA-2500I)均获得对映体基线分离，并且发现较低的柱温(例如20℃)和较低的极性组分(乙醇等)含量(≤5％)有利于对映体的分离。其中Chiralcel OD柱被用于纯对映体样品的收集。利用旋光(ORD)和圆二色(CD)检测器得到了对映体的出峰次序和CD光谱图。进一步结合八区律规则，确定了AF对映体的绝对构型为S-(+)-AF和R-(-)-AF。 通过建立体内和体外生物模型，研究了AF和LCT在发育毒性、内分泌干扰和免疫毒性上的对映体选择性：以斑马鱼胚胎为模型，以心包囊肿、卵黄囊肿和身体弯曲等检测终点为指标开展发育毒性的研究，结果表明存在显著的对映体选择性，(+)-AF和(-)-LCT的致畸效应均高于它们各自的对映体，并表现出一定的剂量效应关系。进一步利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)研究了经AF对映体暴露后，胚胎中雌激素受体基因ERα的表达变化。结果表明，AF两个对映体对ERα mRNA表达的诱导差异达到了3.2倍。但是在研究斑马鱼急性毒性时发现AF与LCT的差异较大；AF的对映体选择性急性毒性不显著，而LCT则表现出极强的对映体选择性，(-)-LCT的毒性要比(+)-LCT的高162倍。这可能是由于这两类农药本身性质的差异所导致的。 进一步以人乳腺癌细胞系MCF-7和人巨噬细胞系RAW264.7为模型，研究了LCT在内分泌干扰和免疫毒性上的对映体选择性。结果表明(-)-LCT比(+)-LCT能更强的引起MCF-7细胞的增殖，以及诱导pS2和ERα mRNA的表达。在RAW264.7细胞毒性中也发现了同样的对映体选择性。在细胞生长抑制、凋亡以及p53基因的表达上，(-)-LCT都表现出了更强的细胞毒性。 由于内分泌干扰物(EDCs)的广泛存在，使得EDCs的削减和控制技术成为一个世界性的难题。弄清它们的环境行为是评估EDCs风险和开发有效修复方法的基础。我们以E2为模型化合物，研究了土壤和水体中锰氧化物对E2降解的影响。结果显示：在有锰氧化物存在的灭菌土壤中，初始浓度为0.0267 μmol g-1的E2能在为期4天反应中被快速降解，同时伴有接近与被降解的E2等量的雌酮(E1)生成。这表明，反应中E217位上的羟基被氧化为羰基，同时生成唯一的降解产物E1。在该反应中我们还观察到了Mn(Ⅱ)的释放，而在去除锰的土壤中E2没有降解，因此可以得出结论：正是土壤中的锰氧化物对E2起到了氧化作用。土壤pH值的升高有利于E2的降解，这与该反应中氢离子的释放有关。 在此基础上，利用自己合成的MnO2对包括E1，E2雌三醇(E3)和17α-雌炔醚(EE2)在内的雌激素进行了降解研究，结果表明它们(浓度均为4×10-6 M，pH=4)均能在220分钟左右被有效去除。降解速率随着溶液pH值的降低而增加，这可能是由于MnO2在低pH值时有更强的氧化能力并能提供更多的表面反应位点。溶液中的共存离子(Cu(Ⅱ)，Zn(Ⅱ)，Fe(Ⅲ)和Mn(Ⅱ))，以及反应过程中释放的Mn(Ⅱ)都会降低E2的去除速率。而不同金属离子对反应的抑制效果差异可能是由于金属离子在溶液中的存在形式不同所致。而通过螯合作用，腐殖酸能有效的去除金属离子的影响。1 mg L-1的腐植酸与溶液0.01 M的ZnCl2溶液的结合程度可以达到251 mmol g-1。MCF-7增殖实验表明，MnO2能完全去除该类雌激素的活性，并且无二次污染产生。 通过研究土壤加入草木灰(BRS)后，对异恶草松(CMZ)的吸附。并进一步结合分析了加入BRS前后，土壤中CMZ对稗草的生物可利用性。结果显示，BRS对CMZ的吸附能力比土壤高1000-20000倍以上。土壤对CMZ的吸附量随着BRS量的增加而增加。而在为期9天的生长实验中，CMZ对稗草的抑制也随着BRS的增加而减小。

目录

文摘

英文文摘

第一章手性污染物与生物安全的研究现状

1.前言

2.手性污染物的对映体富集

2.1手性污染物的对映体选择性吸收

2.2手性污染物与酶、功能蛋白的对映体选择性作用

2.3手性污染物的对映体选择性富集

3.手性污染物的对映体选择性代谢

4.手性污染物的对映体选择性毒性

4.1手性污染物急性毒性的对映体选择性

4.2手性污染物活化及致癌的对映体选择性

4.3手性污染物对内分泌干扰的对映体差异

4.4手性污染物对免疫的对映体选择性

5.生物体对手性分子的识别机理

5.1单手性中心分子的手性识别

5.2多手性中心分子的手性识别

6.对手性污染物(农药)危险评估的建议

7.手性污染物与环境安全的研究展望

8.本课题立题意义和主要内容

参考文献

第二章高效氯氟氰菊酯和三氯杀虫酯的手性拆分

1.前言

2.实验材料与方法

2.1实验材料和试剂

2.2实验仪器和方法

3.结果与讨论

3.1对映体的分离和鉴别

3.2对映体的CD谱图

3.3流动相中极性组分的影响

3.4柱温的影响

4.小结

参考文献

第三章三氯杀虫酯的对映体选择性毒性

1.前言

2.实验材料与方法

2.1主要仪器与试剂

2.2 AF对映体绝对构型的判定

2.3斑马鱼的饲养与胚胎收集

2.4斑马鱼极性毒性实验

2.5胚胎暴露实验

2.6胚胎中mRNA的提取和逆转录

2.7实时定量PCR[Rea1-time quantitative(q)RT-PCR]

3.结果与讨论

3.1对映体绝对构型的判定

3.2对映体选择性急性毒性

3.3对映体选择性胚胎毒性

3.3胚胎中ERαmRNA的表达

4.小结

参考文献

第四章高效氯氟氰菊酯对映体选择性毒性

1.前言

2.实验材料与方法

2.1主要仪器与试剂

2.2斑马鱼的急性毒性与胚胎胚胎毒性

2.3细胞毒性实验

3.结果与讨论

3.1对映体选择性急性毒性

3.2对映体选择性胚胎毒性

3.3 LCT内分泌干扰效应

3.4人巨噬细胞系RAW264.7毒性

4.小结

参考文献

第五章雌二醇在土壤中的非生物降解

1.前言

2.实验材料与方法

2.1材料和试剂

2.2土壤

2.3 E2在土壤中的降解

2.4土壤中Mn(Ⅱ)的释放

2.5 E2和E1在土壤上的吸附

2.6样品分析

3.结果与讨论

3.1 E2降解产物的鉴定

3.2 E2在灭菌土壤中的降解

3.3不含锰的土壤对E2和E1的吸附

3.4 pH值对E2降解的影响

3.5 Mn(Ⅱ)的释放

4.小结

参考文献

第六章合成二氧化锰对甾体类雌激素的去除

1.前言

2.实验材料与方法

2.1实验材料

2.2对雌激素的氧化

2.3 Zn2+与HA的结合

2.4分析方法

2.5雌激素活性测定

3.结果与讨论

3.1 MnO2对雌激素的去除效率

3.2溶液pH值对雌激素去除的影响

3.3溶液中共存离子对反应的影响

3.4腐植酸和单宁酸的影响

3.5雌激素活性测定

4.小结

参考文献

第七章生物可利用性中草木灰的影响

1.前言

2.实验材料与方法

2.1实验材料

2.2异恶草松的吸附

2.3温室培养

3.结果与讨论

4.小结

参考文献

第八章主要结论和研究展望

1.本文主要的结论

1.1三氯杀虫酯和高效氯氟氰菊酯对映体的分离与制备

1.2三氯杀虫酯的对映体选择性毒性

1.3高效氯氟氰菊酯的对映体选择性毒性

1.4土壤中锰氧化物在E2降解中的作用

1.5合成二氧化锰对水体中甾体类雌激素的去除

1.6生物可利用性中草木灰的影响

2.工作展望

致谢

攻读博士期间发表或录用论文