耐辐射球菌sbcD基因在其极端抗性机制中的功能研究

摘要

耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)于1956年首次在辐射灭菌后的肉类罐头中发现，它对电离辐射、紫外线、干燥、过氧化氢等一系列的DNA损伤因子都具有极强的抗性。耐辐射球菌的这种极端的抗性表型是因为它具有高效的DNA损伤修复能力。目前对DNA损伤修复机制方面的研究很多，如切除修复、错配修复、重组修复、SOS修复等，且自1999年耐辐射球菌野生株R1全基因组数据公布以来，该菌的重要DNA修复基因的研究都有了很大的进展，但是其独特的极端辐射抗性的机理和分子修复机制仍然有待于进一步的研究。 基于生物信息学和氨基酸序列分析的结果显示，耐辐射球菌SbcCD复合体的SbcD(DR1921)蛋白和SbcC(DR1922)蛋白共同属于MR蛋白家族，且与T4噬菌体、大肠杆菌、真核生物和古细菌的MR蛋白家族成员有着相同的组织方式。真核生物中SbcD基因的直系同源物为MRE11基因，在考察酵母和人的MRE11基因突变的研究中发现，它对于维持基因组的稳定性具有重要的贡献，并与癌症的发生具有一定的相关性。原核生物的SbcD蛋白是DNA重组和损伤修复中的一个重要蛋白因子。大肠杆菌的SbcCD复合体有3'→5'核酸外切酶、解除DNA末端连接蛋白等生物学功能。耐辐射球菌的DNA修复途径不够完整，缺少大肠杆菌中负责DSBs的RecBC途径，而只有SbcCD和RecFOR蛋白，所以我们推测耐辐射球菌的SbcCD途径很可能是其DNA损伤修复的主要途径。 本研究运用生物信息学的方法对耐辐射球菌SbcD进行了初步的生物信息学分析，确定了该基因在染色体上的具体位置，并对SbcD(DR1921)进行了结构域同源性分析和功能预测等。为了进一步研究耐辐射球菌SbcD在DNA损伤修复和氧化抗性等机制中的生物学功能，我们利用反向插入突变的方法构建了耐辐射球菌SbcD的突变体。表型分析显示相对于野生株，突变株表现了对γ射线、紫外线和过氧化氢更强的敏感性。在进一步的生长动力学、基因组修复动力学等研究中发现，耐辐射球菌的SbcD在辐射抗性和DNA损伤修复途径中具有重要的贡献，且是维持基因组稳定的重要蛋白因子。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录、英文缩略表

声明

致谢

第一章 文献综述

第一节 耐辐射球菌的研究综述

1.1耐辐射球菌的形态结构和基因组组成

1.2耐辐射球菌的生理生化和遗传学特性

1.3耐辐射球菌的极端抗性

1.4与耐辐射球菌极端抗性有关的机制

1.5耐辐射球菌的DNA修复系统

1.6耐辐射球菌的抗氧化系统

1.7耐辐射球菌基因组和蛋白质组学研究

1.8耐辐射球菌的比较基因组学及进化分析

第二节SBCD(DR1921)基因的研究综述

2.1大肠杆菌和耐辐射球菌同源重组起始途径的对比

2.2 SbcCD蛋白复合体在同源重组中的作用

2.3耐辐射球菌SbcD蛋白的结构和功能

2.4耐辐射球菌SbcD蛋白的研究意义

参考文献

第二章 耐辐射球菌SBCD生物信息学分析

第一节 引言

第二节 材料与方法

2.1数据库

2.2软件与方法

第三节 结果与讨论

3.1耐辐射球菌sbcD基因在其基因组中的位置和基本特性

3.2耐辐射球菌SbcD的基因和蛋白序列分析

3.3耐辐射球菌SbcD与不同物种的同源序列比对

3.4耐辐射球菌SbcD蛋白的结构域分析

3.5耐辐射球菌SbcD蛋白的三维结构预测

第四节 小结

参考文献

第三章 耐辐射球菌SBCD基因突变株的构建及表型分析

第一节 前言

第二节 实验材料和方法

2.1实验菌株、质粒及其生长条件

2.2主要试剂和仪器

2.3基因组DNA的提取

2.4耐辐射球菌感受态细胞的制备和转化

2.5大肠杆菌感受态细胞的制备

2.6大肠杆菌细胞的转化

2.7耐辐射球菌sbcD基因突变株的构建

2.8过氧化氢处理

2.9 γ射线(60Co)辐照处理

2.10紫外线照射处理

第三节 实验结果与分析

3.1耐辐射球菌sbcD基因突变株的鉴定

3.2耐辐射球菌sbcD基因突变株对γ射线的敏感性显著上升

3.3耐辐射球菌sbcD基因的缺失显著提高了其对紫外线的敏感性

3.4过氧化氢压力下sbcD突变株的生存率显著下降

第四节 讨论与小结

参考文献

第四章 SBCD基因在耐辐射球菌独特的DNA修复机制中的作用

第一节 前言

第二节 材料和方法

2.1实验菌株与质粒

2.2实验试剂和仪器

2.3耐辐射球菌sbcD基因的生长动力学研究

2.4耐辐射球菌脉冲场电泳基因组制备

2.5脉冲场凝胶电泳

2.6活性氧自由基清除能力分析

第三节 结果与分析

3.1耐辐射球菌sbcD基因的突变使其正常产生了迟滞

3.2 sbcD基因的突变使辐照条件下的菌体量显著下降

3.3辐照胁迫下sbcD基因突变株的基因组恢复明显延迟

3.4 sbcD基因的突变不影响耐辐射球菌的自由基清除能力

第四节 讨论与小结

参考文献

第五章 总结与展望

5.1研究总结

5.2本研究的创新点

5.3研究展望

作者简历、攻读硕士学位期间所发表的论文