耐辐射异球菌R1pprM基因在改良植物抗旱性状中的应用

摘要

本发明发现耐辐射异球菌Deinococcus radiodurans R1中的pprM基因具有增强原核生物及植物的抗旱能力。本发明构建了包含上述基因的重组载体，把它们分别导入原核及真核宿主细胞。实验证实，将pprM基因在原核宿主细胞及植物中表达后，均能增强对干旱环境的抗性。

说明书

技术领域

本发明涉及耐辐射异球菌R1 pprM基因(Deinococcus radiodurans R1 pprM)的新功 能，具体涉及该pprM基因在改良植物对干旱胁迫抗性等方面的用途。

背景技术

耐辐射异球菌Deinococcus radiodurans R1是1956年Anderson等人从经过辐射灭菌 处理的罐头中发现的一种红色细菌。

Deinococcus radiodurans R1中的pprM基因(DR_0907，GeneID：1797366)注释为冷 激蛋白，在2009年Hirofumi Ohba等人发现该基因能依赖于PprI调控PprA等一系列DNA损伤 修复相关的蛋白(Ohba，H.Satoh，et al.，2009)来参与电离辐射后的DNA损伤修复，该基因 也是Deinococcus radiodurans R1具有辐射抗性的关键基因。

尽管一般认为辐射抗性与干旱胁迫抗性在进化上具有协同性，但目前有关Deinococcus radiodurans R1 pprM基因对于提高植物抗旱性能的研究，并未见有报道。

发明内容

本发明的目的是从D.radiodurans R1基因组中发现能够增强植物干旱抗性的基因。并 将该基因转入植物，使其获得抵抗干旱的能力。

本发明人发现，Deinococcus radiodurans R1 pprM基因(DR_0907，GeneID：1797366) 具有抗旱的功能，可用于培育抗旱性状的植物。

本发明进行了如下工作：

1.通过PCR从D.radiodurans R1(DSM 20539)菌株基因组扩增出D.radiodurans R1 pprM基因(DR_0907)，基因序列号为：GeneID：1797366。其大小为402bp，将其克隆 于载体pGEMT-easy上，构建了含有完整pprM基因的重组质粒pGEMT-pprM；

2.将能在大肠杆菌和耐辐射异球菌中都起作用的groEL启动子连接于上述pGEMT -pprM重组质粒上，构建具有groEL含完整的pprM基因的重组质粒pGEMT-pprMG；

3.将导入pprM基因的重组质粒pGEMT-pprMG转入受体大肠杆菌JM109中，获 得工程菌株JM_pprM；

经实验证实，该菌株具有分别抵抗4M NaCl和高浓度(3M)山梨醇(Sorbitol)冲击 的能力(因Sorbitol具有吸湿性，高浓度的Sorbitol溶液可以模拟干旱的环境，详见实施 例2)；

4.将D.radiodurans R1 pprM基因(DR_0907)连接到植物表达载体pBI121中，构 建具有pprM基因的重组质粒pBI121-pprM；

5.将pBI121-pprM重组质粒导入不具干旱抗性的油菜中，获得能够耐受干旱的油 菜植株；

实验结果表明含有本发明所得的D.radiodurans R1 pprM基因的转基因油菜获得了较 强的对干旱的耐受能力(详见实施例5，6，7)。

附图说明：

图1是含有D.radiodurans R1 pprM基因(DR_0907)序列的PCR产物；

图2是含有D.radiodurans R1 pprM基因(DR_0907)及groEL启动子的原核表达载 体的构建验证电泳图谱；

图3是含有D.radiodurans R1 pprM基因(DR_0907)序列的植物表达载体构建的验 证电泳图谱；

图4是在冲击试验前的含有空载体和含有D.radiodurans R1 pprM基因(DR_0907) 序列的原核表达载体的大肠杆菌的生长状况，其中：

a是含有空表达载体的大肠杆菌JM 109菌株；

b是含有D.radiodurans R1 pprM基因(DR_0907)序列表达载体的大肠杆菌JM109 菌株；

图5是含有D.radiodurans R1 pprM基因(DR_0907)序列的原核表达载体及空载体 的大肠杆菌(E.coli)在含3M山梨醇的培养基中生长状况，证明D.radiodurans R1 pprM 基因(DR_0907)能够增强大肠杆菌具有抗旱的功能。图中的菌株如下：

a是含有空表达载体的大肠杆菌JM109菌株；

b是含有D.radiodurans R1 pprM基因(DR_0907)序列表达载体的大肠杆菌JM109 菌株。

图6含有D.radiodurans R1 pprM基因(DR_0907)序列表达载体及空载体的大肠 杆菌在含4M NaCl的培养基中生长状况，证明D.radiodurans R1 pprM基因(DR_0907) 具有耐盐抗性。图中的菌株如下：

a是含有空表达载体的大肠杆菌JM109菌株；

b是含有D.radiodurans R1 pprM基因(DR_0907)序列表达载体的大肠杆菌JM109 菌株。

图7是转基因油菜的RT-PCR验证。

图8是转pprM基因的油菜在处理前的状态。

图9是阴性对照(非转基因的油菜)在处理前的状态。

图10是转pprM基因的油菜停止浇水1周的状态。

图11是阴性对照(非转基因的油菜)停止浇水1周的状态。

图12是转pprM基因的油菜停止浇水2周的状态。

图13是阴性对照(非转基因的油菜)停止浇水2周的状态。

图14是干旱胁迫后转基因油菜和野生型油菜植物组织细胞膜渗透性对比，其中纵坐 标表明离子渗透率。

图15是干旱胁迫后转基因油菜和野生型油菜叶片丙二醛含量对比，其中纵坐标表明 丙二醛含量。

具体实施方式

以下实施例中所举的质粒、菌株只是用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明 的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条 件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例中所举的质粒、菌株来源如下：

克隆载体pGEMT-easy：为Promrga公司市售产品；

植物表达载体pBI121：为Clontech公司市售产品；

大肠杆菌JM 109：为北京全氏金公司市售产品。农杆菌EHA 105由本实验室保存

实施例1 D.radiodurans R1 pprM基因序列在大肠杆菌中的表达

根据已公布的D.radiodurans R1基因组中的pprM基因序列设计一对PCR特异性引 物，从D.radioduransR1基因组DNA中扩增完整的核苷酸序列。

Up 5′AGCGACTAGT GCCAAAT ATGTGCCGAGTTTC 3′；Down 5′ATCCCATATG TTACCAGCGGTCGTCGCGGC3′。通过PCR方法从D.radiodurans R1的基因组中扩增出序 列SEQ ID NO：1，条件：95℃10min，[95℃30sec，55℃30sec，72℃45sec]30个循环，72℃ 10min，PCR产物经胶回收后，克隆于载体pGEMT-easy上，命名为pGEMT-pprM，然后 将来自于D.radiodurans R1的groEL启动子也连到这个载体上，构建大肠杆菌表达载体 pGEMT-pprMG，将该表达载体转化大肠杆菌JM109，经PCR、酶切，测序三方面验证插 入序列的正确(见图1，2)，将该菌株命名为JM_pprM。

将含有pGEMT-easy+groEL空质粒的E.coli JM109命名为JM_pGEMT-G。

实施例2含D.radiodurans R1 pprM基因的工程菌株提高干旱和盐的耐受性实验

一、实验方法

1、将实施例1中所得的两个重组的大肠杆菌接种于20mL LB液体培养基中，摇瓶培 养3-4h后，再转接于100mL的LB液体培养基中，尽量保持接种量的一致，培养至OD 0.3-0.4之间，尽量调至OD值一致。

2、取10mL的菌液离心后，在等体积的4M NaCl盐溶液和3M的山梨糖醇溶液里冲 击2h，每个样品立即用无菌去离子水等比稀释至10^-4，取10μL点在LB固体培养基表面， 经37℃培养16h，观察并照相。4M NaCl盐溶液和3M的山梨糖醇均为高渗溶液，能模拟 干旱胁迫。

二、实验结果

从图4中可看出，冲击前含有D.radiodurans R1 pprM基因(DR_0907)的JM_pprM 菌株与含空质粒的JM_pGEMT-G菌株生长状态基本一致；4M NaCl盐溶液和3M山梨醇 冲击后，含有D.radiodurans R1 pprM基因(DR_0907)的JM_pprM菌株生长状况良好， 菌落数目明显多于只含空质粒的JM_pGEMT-G菌株(见图4，5，6)。

三、结论

D.radiodurans R1 pprM基因能帮助原核生物耐受干旱和盐的胁迫。

实施例3 D.radiodurans R1 pprM基因在油菜细胞中进行真核细胞表达及转基因植株的 鉴定

(一)含目的基因植物表达载体的构建

根据D.radiodurans R1基因组序列设计pprM基因用于植物表达的引物，上游引物加 Bam HI，下游引物加Sac I两个酶切位点，且把起始密码子从gtg改为atg。引物序列如下： DR0907 PLANT UP：CGGCGGATCC ATGTGCCGAGTTTCGATTGT；

DR0907 PLANT DOWN：ATTAGAGCTC TTACCAGCGGTCGTCGCGGC。

且上游带有Bam HI酶切位点，下游带有Sac I酶切位点，将pprM(DR_0907)基因 从基因组中扩增出来，片段经Bam HI，Sac I双酶切胶回收后连接到同样双酶切的植物表达 载体pBI 121上，构建出含有完整的DR0907基因的表达载体pBI 121-pprM(见图3)。

(二)农杆菌介导转化油菜实验

1.根癌农杆菌EHA105感受态的制备：

1)挑取单菌落，接种于5mL YEB液体培养基(含利福平Rif 50mg/L)，28℃，250 rpm振荡培养过夜；

2)取2mL菌液，加入50mL YEB液体培养基(含Rif 50mg/L)中，28℃，250rpm 振荡培养至OD₆₀₀约0.6左右；

3)将菌液转至50mL无菌离心管中，冰浴30min，5000×g离心5min；

4)弃上清，沉淀用2mL 20mM CaCl₂重浮，每份100μL分装到1.5mL离心管中， 液氮中保存备用。

2.重组质粒DNA转入农杆菌：

1)将约1μg的pBI-pprM质粒DNA分别加入到100μL EHA105感受态细胞中，混 匀，冰浴5min；

2)将离心管置液氮中冷冻8min，迅速转至37℃水浴中温浴5min；

3)加入1mL YEB液体培养基，在28℃摇床上250rpm复苏4～5h；

4)取适量菌液涂布到含利福平(Rif)50mg/L和卡那霉素(Kan)100mg/L的YEB固体 培养基上，置28℃培养24～48h。

3.农杆菌的质粒的提取

1)挑取菌落于含利福平(Rif)50mg/L和卡那霉素(Kan)100mg/L的YEB液体培养 基中(YEB：胰蛋白胨5g/L，酵母提取物1g/L，蔗糖5g/L，硫酸镁0.5g/L)，28℃，250 rpm振荡培养20h；

2)取1.5mL菌液离心后，弃上清，用STE溶液(Tris-HCI 10mM pH8.0，NaCl 10mM， EDTA 10mM pH 8.0)洗涤两次，弃上清，加入预冷的溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl pH8.0，10mM EDTApH 8.0，RNaseA 100μg/mL)300μL，用移液器反复抽吸混匀，室温 静置10min；

3)加入新鲜配置的溶液II(0.2M NaOH，1％SDS)600μL，上下颠倒几次混匀；

4)加入预冷的溶液III(5M乙酸钾pH 5.2，冰醋酸11.5mL，加水至100mL)450μL， 充分混匀，冰浴5min，4℃12000×g离心5min，取上清用0.6倍体积的异丙醇沉淀；

5)沉淀用TE(Tris-HCl 10mmol/L，1mmol/LEDTA，pH 8.0)溶解后，经PCR、Bam HI、Sac I双酶切验证。

4.油菜无菌苗的准备及农杆菌介导的pprM基因遗传转化

1)油菜无菌苗的培养

甘蓝型油菜(Brassica napus L.)(84100-18)种子在超净工作台上用灭菌水浸泡10min， 10％的NaClO灭菌12min，再用0.1％的升汞溶液消毒7-8min，用灭菌水洗3-5遍，并 把灭菌的油菜种子均匀地摆放在无激素的预培养基上(7.5％琼脂)。光照培养，4-5d 龄油菜幼苗最适于遗传转化。

2)预培养

用75％的酒精和高温消毒灭菌的剪刀剪掉子叶和生长点，剪取油菜无菌苗紧邻生长 点下约0.5cm长的下胚轴，置于预培养基(MS+6-BA 2mg/L+2，4-D 1 mg/L+AgNO₃ 2.5 mg/L+AS 19.62mg/L)上，光照预培养2d。

3)农杆菌的培养

在50mL LB液体培养基(含卡那霉素100mg/L、利福平50mg/L)中加入0.1mL pprM-EHA 105菌液，28℃下220rpm振荡培养16h左右，室温下4000×g离心10min， 弃上清液，菌体用灭菌的MS液体培养基(含AS 100μmol/L)悬浮，稀释到原体积的5-20 倍，在28℃下220rpm振荡培养1h，使菌液的OD₆₀₀达0.5左右。

4)共培养

把预培养2d的下胚轴放入菌液中浸染1min，用药勺捞出下胚轴，放在灭菌的吸水 纸上，吸干下胚轴上的多余菌液，再放到覆盖有灭菌滤纸的预培养基上，用封口膜封好培 养皿，25℃左右，于暗处共培养约2d(暗培养)。

5)诱导培养

把共培养2d的下胚轴放到诱导培养基(MS+6-BA 2mg/L+AgNO₃ 2.5mg/L)上，用 封口膜封好培养皿，25℃左右光照培养，每两周继代一次，直至长出膨大的愈伤组织。

6)选择培养

把膨大的愈伤组织转移到到筛选培养基(MS+6-BA 2mg/L+AgNO₃2.5mg/L+Kan 100 mg/L)上，用封口膜封好培养皿，25℃左右光照培养，每两周继代一次，直至长出苗。

7)生根培养

当幼芽长到1-2cm高时，把它们从愈伤组织上分离，转移到生根培养基上(1/2 MS+NAA 0.5mg/L+Kan 25mg/L)进行生根培养。在抗生素筛选条件下，约87％的芽在两 周后形成根。

8)炼苗和移栽

生根后的幼苗长到5-6cm高时，半敞开培养瓶盖子，进行炼苗；待幼苗适应外界环 境以后，转移到室内灭菌的蛭石中栽种培养，并用1/2MS培养液浇灌。当幼苗生长至7-9 cm时，将幼苗移植到泥土中生长，然后再进行下一步实验。

实施例4利用RT-PCR方法检测pprM基因在转基因油菜植株中的表达

1植物总RNA的提取

使用上海华舜生物技术有限公司生产的柱离心式小量植物总RNA抽提试剂盒提取 获得的转pprM基因油菜的RNA，并用DNase I处理DNA。

2RT-PCR

反转录使用NEB公司的试剂盒(DyNAmo^TM cDNA Synthesis Kit)。以反转录得到的 cDNA为模板，利用引物DR0907 PLANT UP：CGGCGGATCC ATGTGCCGAGTTTCGATTGT；

DR0907 PLANT DOWN：ATTAGAGCTC TTACCAGCGGTCGTCGCGGC进行PCR反 应，条件为：95℃10min，[95℃30sec，55℃30sec，72℃45sec]30个循环，72℃10min。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，测序验证。表明pprM基因已经成功的转入到油 菜内(见图7)。

实施例5 转pprM基因植物的抗旱实验(1)——油菜植物叶片含水量测定

鉴于该核苷酸序列已被证明在大肠杆菌中对干旱胁迫具有抗性，进一步对转基因植株 进行抗旱性鉴定。

对油菜一次性浇足营养液后不再浇水，每隔一天测定叶片含水量。含水量的测定方法： 约0.1g叶片从植株上取下后，立即称取鲜重(FW)，然后将叶片浸入去离子水中4小时，取 出用滤纸吸去表面水分，称取饱和鲜重(TW)，然后将叶片放入烘箱于70℃烘干至恒重，称 取干重(DW)。

相对含水量(Relativewatercontent，RWC)(％)＝(FW-DW)/(TW-DW)×100％。

植株在干旱处理过程中，叶片相对含水量逐渐下降，且随着干旱处间的延长，转基因 植株相对含水量与野生型的差异逐渐明显。野生型植株在干早胁迫第4天时，叶片已经开 始萎蔫，含水量急剧下降；转基因的油菜干旱胁迫第7天时，叶片才开始萎蔫，叶片失水 速度明显比野生型缓慢；干早胁迫14天后，对照植株的叶片相对含水量降到49％，而转基 因株系的相对含水量在64-68％之间，远高于对照植株(见图8，9，10，11，12，13)。

实施例6转pprM基因植物的抗旱实验(2)——干旱胁迫后转基因油菜和野生型油菜植 物组织细胞膜渗透性对比

1)实验目的

当植物受到逆境影响时，如高温或低温、干旱、盐渍、病原菌侵染后，细胞膜遭到破 坏，膜透性增大，从而使细胞内的电解质外渗，以致植物细胞浸提液的电导率增大。膜透 性增大的程度与逆境胁迫强度有关，也与植物抗逆性的强弱有关。这样，比较同一作物不 同品种在不同胁迫温度下膜透性的增大程度，即可比较作物间的抗性强弱。因此，电导仪 法已成为目前作物抗逆性栽培、育种上鉴定作物抗逆性强弱的一个精确而实用的方法。

干旱胁迫常常引起植物细胞损伤，导致细胞膜离子渗透率增加和脂膜过氧化。

2)实验材料

a转pprM基因的油菜(获得方法见实施例2)和野生型的油菜同时一次性浇足营养液 后不再浇水，干旱处理第8天的叶片；

b未经干旱处理的转基因及野生型的油菜叶片；

3)实验方法和步骤

经过干旱处理的油菜叶片和没有经过干早处理的油菜叶片约0.1g，用双蒸水冲3次， 以吸水纸轻轻吸干叶片表面水分，将叶片剪碎置于25mL双蒸水中，在真空干燥器中于 0.05MPa下抽气20min，25℃下缓慢振荡2h，然后测定电导率S1，同时测定水的空白电导 率C1。再将样品在沸水浴中处理20min，冷却至室温后定容到25mL测定电导率S2，以相同 方式处理水，测定其空白电导率C2。离子渗透率＝(S1-C1)/(S2-C2)×100％。

4)实验结果

未处理的植株中，离子渗透率在12-15％之间；干旱处理8天，野生型的植株的叶片细 胞膜离子渗透率达到32％；转基因植株的离子渗透率为22-24％，显著小于野生型植株(见 图14)。

实施例7转pprM基因植物的抗旱实验(3)——干旱胁迫后转基因油菜和野生型油菜叶 片丙二醛含量比对

1)实验目的

本实验采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法。其原理为：植物在逆境条件下，往往发生膜 脂过氧化作用，丙二醛(malondialdehyde，MDA)是其产物之一，通常利用它作为脂质过氧 化指标，表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。

丙二醛在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反应，形成在532nm波长处有最 大光吸收的有色三甲基复合物，该复合物的吸光系数为155[mmol/(L*cm)]，并且在600nm 波长处有最小光吸收。可按下列公式：

A₅₃₂-A₆₀₀＝155000×C×L        (1)

算出MDA浓度C(μmol/L)，进一步算出单位重量鲜组织中MDA含量C(μmol/g)。 式中A₅₃₂和A₆₀₀分别表示532nm和600nm波长处的吸光度值。L为比色杯厚度(cm)。

需要指出的是，植物组织中糖类物质对MDA-TBA反应有干扰作用。为消除这种干 扰，经试验，可用下列公式消除由蔗糖引起的误差。

C/μmol/L＝6.45(A₅₃₂-A₆₀₀)-0.56A₄₅₀          (2)

式中：A₄₅₀、A₅₃₂、A₆₀₀分别代表450nm、532nm和600nm波长下的吸光度值。 用公式(2)可直接求得植物样品提取液中MDA的浓度，进一步算出其在植物组织中的含 量。

2)实验材料

a转pprM基因的油菜(获得方法见实施例2)和野生型的油菜同时一次性浇足营养液 后不再浇水，干旱处理第8天的叶片；

b未经干旱处理的转基因及野生型的油菜叶片。

3)实验方法和步骤

a取0.5g油菜叶片，共4份，分别加入5％TCA 5mL，研磨后所得匀浆在3000×g 下离心10min；

b取上清液2mL，加0.67％TBA 2mL，混合后在100℃水浴上煮沸30min，冷却后再 离心一次；

c分别测定上清液在450nm、532nm和600nm波长下的吸光度值，并按公式(2)算出 MDA浓度，再算出单位鲜重组织中的MDA含量(μmol/g)；

d所得数据采用方差分析检验两个不同油菜MDA含量的差异性。

4)实验结果

干旱胁迫后，转基因植株的丙二醛的含量也低于野生型(见图15)。

以上实验证明转Deinococcus radiodurans R1中pprM基因的油菜的抗逆性远远高于 对照组的油菜。