卵巢癌患者外周血和腹水T淋巴细胞的凋亡特点以及sFas对T淋巴细胞凋亡影响

摘要

卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤，卵巢癌的自身特点和患者免疫系统的异常使卵巢癌被确诊时大多已是晚期，治疗难度大。虽然近年来卵巢癌手术和化疗有了长足的进展，但其预后尤其晚期病例的五年生存率仍无显著改善。卵巢癌需要一个综合性治疗，而抑制肿瘤免疫逃逸或免疫反击是目前卵巢癌免疫治疗研究的一个热点。 有效的免疫治疗需要建立在对肿瘤免疫缺陷及影响因素的全面了解基础上。目前已有不少关于卵巢癌和其他肿瘤影响肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的凋亡和功能的研究。卵巢癌易腹腔内扩散，而且有研究显示，卵巢癌患者腹水中淋巴细胞的表型不同于胃肠道肿瘤。可见，原发性卵巢癌可能具备其独特的腹腔免疫损伤因素，这造成了卵巢癌腹腔内广泛播散的独特生物学行为。因此有必要对卵巢癌患者的全身及腹腔局部的免疫缺陷的特点及其影响因素作进一步了解。 Fas／APO-1／CD95及其配体：FasL(Fas Ligand)属TNF和NGF受体家族，为跨膜蛋白分子，细胞表面Fas和FasL结合引导细胞凋亡。Fas以细胞表面蛋白(mFas)和可溶性蛋白(sFas)两种形式存在。sFas可以由变异的mRNA剪接体表达产生，也可以由细胞表面形式的Fas经溶蛋白性裂解释放产生。因sFas跨膜区域缺损，凋亡介导功能缺失，因此目前很多研究都认为sFas可通过与细胞表面Fas竞争结合FasL而起到抑制肿瘤细胞凋亡的作用。在许多妇科肿瘤如宫颈癌、子宫内膜癌和卵巢癌患者的血清中都可以检测到sFas水平的增高。与其他实体肿瘤相比，卵巢癌腹腔局部免疫缺陷是其一个重要的特点，然而目前针对卵巢癌患者腹水中的sFas水平及功能的研究还不多。 现已证实，肿瘤细胞可以通过各种机制造成宿主的免疫缺陷，从而实现肿瘤免疫逃逸，肿瘤诱导淋巴细胞凋亡就是其中机制之一。目前研究显示，肿瘤细胞可以通过Fas／FasL途径诱导淋巴细胞的凋亡。那么作为凋亡抑制因子的sFas在抑制癌细胞凋亡的同时是否也可以通过抑制FasL与淋巴细胞表面Fas的结合来下调肿瘤细胞对免疫细胞的促凋亡作用呢?这方面的研究不多，并且存在争议。 为了解卵巢癌患者全身及腹腔局部的淋巴细胞凋亡状况，以及sFas在卵巢癌患者T淋巴细胞凋亡过程中的作用，本文利用酶联免疫吸附试验、免疫沉淀、细胞培养和流式细胞仪分析等技术从两个方面进行研究：1.卵巢癌患者外周血和腹水T淋巴细胞的凋亡特点及T淋巴细胞凋亡与Fas表达、CAl25水平和sFas水平的关系。2.通过体外试验研究重组人sFas及卵巢癌腹水sFas对Jurkat细胞凋亡的影响。 第一部分卵巢癌患者外周血和腹水T淋巴细胞的凋亡特点及相关因素的研究 第一节外周血和腹水T淋巴细胞凋亡特点及其与Fas表达和血清CA125水平的关系 材料与方法：应用流式细胞术测定18例Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌患者(晚期卵巢癌组)，16例Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者(早期卵巢癌组)，Ⅲ～Ⅳ期组患者手术加化疗后(治疗后晚期卵巢癌组)，19例良性上皮性卵巢肿瘤患者(良性卵巢肿瘤组)，6例库肯勃氏瘤患者(转移性卵巢癌组)及21例正常体检女性(健康对照组)的外周血T淋巴细胞凋亡和Fas表达，并测定上述治疗前的卵巢癌患者和库肯勃氏瘤患者的腹水T淋巴细胞以及良性卵巢肿瘤组中10例患者的盆腔积液T淋巴细胞的凋亡和Fas表达。同时测定卵巢癌患者外周血CAl25的水平。 结果：晚期卵巢癌组患者的外周血T淋巴细胞凋亡阳性率为5.81(4.08～10.18)％，显著高于健康对照组、良性卵巢肿瘤组、早期卵巢癌组(P<0.008)和治疗后晚期卵巢癌组(P<0.05)。晚期卵巢癌组患者的外周血T淋巴细胞Fas阳性率和FasMean值分别为44.36±6.07和49.51±5.72，均显著高于健康对照组(P<0.05)。早期卵巢癌组和晚期卵巢癌组患者腹水T淋巴细胞的凋亡阳性率，T淋巴细胞的Fas阳性率，Fas表达强度分别为17.4l(7.97～30.95)％，(54.13±13.39)％，55.16±9.12和．34.06(16.33～43.64)％，(62.23±11。69)％，67.70±23.65，均高于良性卵巢肿瘤组的0.89(0.7l～1.76)％，(35.92±6.05)％，41.88±6.07(P<0.01)。晚期卵巢癌组的凋亡阳性率和Fas阳性率均显著高于转移性卵巢癌组(P<0.05)。在卵巢癌患者腹水中，T淋巴细胞Fas表达阳性率和Fas表达强度均与患者的T淋巴细胞凋亡阳性率呈正相关(r=0.534,P=0.000：r=0.594,P=0.000)。早期卵巢癌组患者腹水T淋巴细胞凋亡与血清CAl25水平呈正相关(r=0.801，P=0.000)。血清CAl25>500KU／L的卵巢癌患者腹水T淋巴细胞的凋亡阳性率高于CA125±500KU／L的患者(P<0.05)。 第二节外周血和腹腔液T淋巴细胞凋亡与sFas水平的相关性 材料与方法：采用ELISA及流式细胞仪测定22例Ⅲ～Ⅳ期，10例Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者及8例良性卵巢肿瘤患者的外周血和腹腔液的sFas水平与T淋巴细胞凋亡水平。 结果：晚期卵巢癌患者的外周血和腹腔液sFas水平以及T淋巴细胞凋亡均显著高于早期卵巢癌及良性卵巢肿瘤患者(P<0.01)。早期卵巢癌患者的腹腔液sFas水平以及T淋巴细胞凋亡显著高于良性卵巢肿瘤患者(P<0.01)。晚期卵巢癌患者的腹腔液sFas水平与T淋巴细胞的凋亡呈正相关(r=0.647,P=0.001)。 第二部分重组人sFas及卵巢癌腹水sFas对Jurkat细胞凋亡的影响 材料与方法：采用ELISA、细胞培养、免疫沉淀、MTT及流式细胞仪技术研究重组人sFas及卵巢癌腹水sFas对Jurkat细胞凋亡的影响结果：重组人sFas对Jurkat细胞的生长及凋亡无显著影响。卵巢癌腹水能诱导Jurkat细胞凋亡增加。腹水经免疫沉淀去除sFas后，腹水诱导Jurkat细胞凋亡的水平无显著上调或下降。Jurkat细胞表面的Fas通过单抗封闭后，腹水诱导Jurkat细胞凋亡的水平显著下降。 结论： (1)卵巢癌患者T淋巴细胞的凋亡水平显著增高，其特点为腹水中淋巴细胞凋亡上调早于外周血、原发性癌高于转移性癌，提示该淋巴细胞凋亡特点可能是造成卵巢癌易腹腔内广泛播散的原因之一。 (2)卵巢癌患者T淋巴细胞Fas表达显著升高，且变化规律与细胞凋亡相一致，提示卵巢癌细胞可能通过诱导淋巴细胞Fas高表达而促进其凋亡。 (3)血清CAl25水平可间接反映早期卵巢癌T淋巴细胞凋亡的状况。 (4)卵巢癌患者外周血与腹水的T淋巴细胞凋亡与sFas水平同步增高，而且晚期卵巢癌患者腹水的T淋巴细胞凋亡与sFas水平呈正相关，提示sFas可能与T淋巴细胞凋亡有关。 (5)卵巢癌腹水可体外诱导淋巴细胞凋亡，且可通过封闭淋巴细胞表面Fas表达部分消除，但重组人sFas不能诱导淋巴细胞凋亡，去除腹水中sFas也未能消除腹水对淋巴细胞的凋亡诱导作用。提示卵巢癌腹水诱导淋巴细胞凋亡由Fas介导，但不通过sFas起作用。 (6)卵巢癌腹水sFas水平可以间接反映腹腔淋巴细胞凋亡的状况。

目录

前言

第一部分卵巢癌患者外周血和腹水T淋巴细胞的凋亡特点及相关因素

第一节外周血和腹水T淋巴细胞凋亡特点及其与Fas表达和血清CA125水平的关系

第二节外周血和腹腔液T淋巴细胞凋亡与sFas水平的相关性

第二部分重组人sFas及卵巢癌腹水sFas对淋巴细胞凋亡的影响

结论

sFas/sFasL的研究进展

附录 发表论文

致谢