5-氨基乙酰丙酸脱水酶的克隆表达与酶学性质的初步研究

摘要

5-氨基乙酰丙酸(ALA)是生物体内四吡咯化合物(如亚铁血红素、卟啉、叶绿素和维生素B<,12>等)的共同前体，广泛存在于微生物、植物和动物细胞中。近年来，研究发现ALA不仅可作绿色除草剂和生物杀虫剂，还可用于癌症治疗、皮肤病治疗、铅中毒检测等领域，是一种非常有前途的光动力学药物。 本实验室已利用生物体内的碳四途径，成功构建了高产ALA的重组大肠杆菌。通过过量表达ALA合成酶催化琥珀酰辅酶A和甘氨酸的缩合反应，使得ALA的发酵水平到达了6.6 g/L(50 mM)。 5-氨基乙酰丙酸脱水酶(ALAD，又名胆色素原合成酶PBGS，E．C．4.2.1.24)能够催化两分子ALA不对称缩合形成胆色素原。作为ALA代谢途径的下游酶，在重组工程菌的发酵生产过程中，脱水酶会导致ALA积累量的减少，但缺乏该酶又会影响细胞的正常生理活动。因此，深入了解ALAD的酶催化动力学特征，采用一定的手段在产ALA期间部分抑制ALAD的活性，就有可能进一步提高ALA产量。 本工作将大肠杆菌Rosseta(DE3)的ALAD基因(hemB)克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)上，重组质粒命名为pET28a-hemB。将pET28a-hemB转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，成功构建了重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-hemB，并使融合蛋白带上6His亲和标签。重组菌经1 mM IPTG诱导表达后，SDS-PAGE结果显示，在36.5 kD处蛋白获得过量表达，经改良的Ehrlich试剂显色反应测定ALAD活力，结果发现重组ALAD比活力达到3.10×10<'3> U/mg protein。 研究重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-hemB生产5-氨基乙酰丙酸脱水酶的诱导条件，确定了摇瓶发酵的最优诱导条件为：发酵开始后2 h添加诱导剂，诱导剂IPTG终浓度为0.4 mM，诱导后的培养温度为28℃，诱导后的表达时间以4 h为宜。通过亲和层析、凝胶过滤层析和冷冻干燥三个步骤得到5-氨基乙酰丙酸脱水酶纯品。经过整个分离纯化过程，5-氨基乙酰丙酸脱水酶的比活力提高了6.19倍。 对重组ALA脱水酶进行了一系列酶学性质的研究，该酶的最适pH值为7.5，最适反应温度为37℃，K<,m>为0.569 mM，Mn<'2+>、Ca<'2+>和K<'+>能够显著提高酶活力，Cu<'2+>和Li<'+>显著抑制了酶活力，10 mM金属离子螯合剂EDTA可导致近90％的酶活力丧失，Mg<'2+>对酶活性起着重要作用，低浓度的二硫苏糖醇能够提高ALA脱水酶活性，底物类似物乙酰丙酸、D-葡萄糖以及D-木糖对该酶有着显著的抑制作用。

目录

文摘

英文文摘

第一章文献综述

1.1引言

1.2 ALA的应用与前景展望

1.2.1 ALA在植物中的作用机理及农业上的用途

1.2.2医学领域的应用价值

1.3 5-氨基乙酰丙酸的生产

1.3.1化学法合成5-氨基乙酰丙酸

1.3.2生物合成5-氨基乙酰丙酸的途径

1.3.3生物法合成5-氨基乙酰丙酸

1.4 5-氨基乙酰丙酸脱水酶的研究进展

1.4.1 5-氨基乙酰丙酸脱水酶基因和结构的保守性

1.4.2 5-氨基乙酰丙酸脱水酶催化反应机理和金属依赖性

1.4.3 5-氨基乙酰丙酸脱水酶的抑制剂

1.5本课题拟研究内容

第二章5-氨基乙酰丙酸脱水酶重组菌的构建

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1质粒与菌株

2.2.2培养基

2.2.3酶和试剂

2.2.4主要实验仪器

2.2.5质粒提取和转化

2.2.6 DNA的纯化和回收

2.2.7 DNA的检测

2.2.8 5-氨基乙酰丙酸脱水酶基因的克隆与重组质粒的构建

2.2.9菌体培养及酶蛋白表达

2.2.10测定方法

2.3结果与讨论

2.3.1 E.coli Rosseta(DE3)基因组的提取

2.3.2聚合酶链式反应获得hemB

2.3.3克隆载体的鉴定

2.3.3表达载体的鉴定

2.3.4 E coli Rosseta(DE3)-hemB基因序列分析

2.3.5重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE

2.3.6工程菌5-氨基乙酰丙酸脱水酶活性的初步检测

2.4小结

第三章5-氨基乙酰丙酸脱水酶的诱导表达与纯化

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1实验菌株

3.2.2培养条件与样品处理

3.2.2主要试剂

3.2.3实验仪器

3.2.4诱导条件的优化

3.2.5 5-氨基乙酰丙酸脱水酶的分离纯化

3.3结果与讨论

3.3.1诱导条件的优化

3.3.2 5-氨基乙酰丙酸脱水酶的分离纯化

3.4 小结

第四章5-氨基乙酰丙酸脱水酶酶学性质的研究

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1实验菌株

4.2.2培养条件与样品处理

4.2.2主要试剂

4.2.3实验仪器

4.2.4 pH值对5-氨基乙酰丙酸脱水酶活力的影响

4.2.5温度对5-氨基乙酰丙酸脱水酶活力的影响

4.2.6金属离子和EDTA对5-氨基乙酰丙酸脱水酶活力的影响

4.2.7巯醇对5-氨基乙酰丙酸脱水酶活力的影响

4.2.8乙酰丙酸对5-氨基乙酰丙酸脱水酶活力的影响

4.2.9糖类对5-氨基乙酰丙酸脱水酶活力的影响

4.2.10 5-氨基乙酰丙酸脱水酶Km值的测定

4.3结果与讨论

4.3.1 pH值对5-氨基乙酰丙酸脱水酶活力的影响

4.3.2温度对5-氨基乙酰丙酸脱水酶活力的影响

4.3.3金属离子和EDTA对5-氨基乙酰丙酸脱水酶活力的影响

4.3.4巯醇对5-氨基乙酰丙酸脱水酶活力的影响

4.3.5乙酰丙酸对5-氨基乙酰丙酸脱水酶活力的影响

4.3.6糖类对5-氨基乙酰丙酸脱水酶活力的影响

4.3.7 5-氨基乙酰丙酸脱水酶动力学参数的确定

4.4小结

第五章结论与展望

5.1结论

5.2展望

参考文献

致谢