微流控芯片Edman降解及在蛋白质测序中的应用研究

摘要

蛋白质的一级结构,即蛋白质内氨基酸的排列顺序是蛋白质科学研究的前提,获得该信息是一直是生命科学最重要研究内容之一,具有相当重要的意义。然而当前蛋白质序列测定的质谱法和Edman降解法都存在着不足之处。前者的局限在于准确度不高,会产生错误、假阳性的结果：后者灵敏度过低,需要样品量多,难于应用于同疾病相关的低丰度蛋白质序列测定。本文首次研究在微流控芯片内完成Edman降解,大幅度提高了Edman降解法测序的灵敏度,并且通过同MS技术联用,提高痕量蛋白质序列鉴定的准确度。 笫一章综述了蛋白质一级序列测定进展。 第二章研制了体积仅为3.5 nL、可以重复使用的微流控芯片C18固相微萃取装置,研究了在微流控芯片上精确控制纳升级流体的方法。该C18柱可以富集痕量的多肽样品。二维凝胶电泳分离后的蛋白质酶解液通过固相微萃取脱盐后,样品体积由几微升浓缩到50 nL并直接转移至MALDI-TOF-MS靶上进行测定。分析结果表明新的方法能够大幅度蛋白质测定的序列覆盖度。 第三章研究了在微流控芯片用Edman降解测定蛋白质序列的方法和性能,并通过分子量的差别鉴定多肽的序列。采用该方法测定了亚飞摩尔级别合成多肽的序列,比经典的Edman降解法的样品用量降低了数百倍。与MALDI-TOF-MS相结合测定二维凝胶电泳分离后银染蛋白质样品序列时,原先模棱两可的结果有了明确的归属。 第四章通过在微流控芯片上进行一个循环的Edman降解,准确地得到多肽N端氨基酸残基的信息,解决了MS/MS谱图内难以辨别b/y系列离子的难题,并成功地完成了三个多肽样品(包括一个C端修饰的神经多肽)的从头测序。通过两个循环的Edman降解能够得到多肽的N端两个氨基酸残基的序列,根据这些信息能够推断出原始多肽MS/MS谱图中b2离子的摩尔质量。采用b2离子作为内标,可以提高测定MS/MS谱图中其它碎片质荷比的准确度,从而解决了在MS/MS测定时难以用内标法提高测定碎片离子摩尔质量准确度的问题。 第五章旨在提高Edman测序的自动化程度。研究了用注射泵输送气体试剂进行气相Edman降解的方法,用毛细管力将纳升级的液体试剂吸入微流控芯片,并用氮气压力将纳升级的液体试剂定量传输到固定了多肽样品的C18反应柱。实现了飞摩尔级Edman测序操作的初步自动化。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1.引言

1.2.Edman降解法

1.2.1.Edman降解方法学

1.2.2.Edman测序法应用研究

1.2.3.Edman降解-质谱联用技术应用于蛋白质的序列分析

1.3.生物质谱蛋白质序列测定法

1.3.1.肽指纹图谱法(Peptide Mass Fingerprints,PMF)

1.3.2.串联质谱(Tandem Ms)测序技术

1.3.3.MS/MS法的缺点

1.3.4.用化学修饰法提高质谱法鉴定的准确度

1.4.其他蛋白质测序方法

1.4.1.二硝基氟苯(DNFB)法

1.4.2.酶学测序法

1.5.微流控芯片反应器技术研究

1.6.小结

参考文献

第二章纳升级芯片固相萃取系统

2.1.引言

2.2.实验部分

2.2.1.试剂及材料

2.2.2.固相微萃取芯片的制作

2.2.3.微固相萃取系统的组成

2.2.4.C18柱的填充及更换

2.2.5.酶解及萃取条件

2.2.6.普通质谱制样方法

2.2.7.样品的固相微萃取步骤

2.2.8.质谱检测

2.3.结果与讨论

2.3.1.围堰的制备及流体的控制

2.3.2.纳升级流体的控制

2.3.3.微固相萃取柱的优化

2.3.4.微固相萃取柱的灵敏度

2.3.5.填充材料的选择

2.3.6.银染2-DE胶上实际样品的分析

2.4.结论

参考文献

第三章基于微流控芯片的Edman降解法

3.1.前言

3.2.实验部分

3.2.1.试剂及材料

3.2.2.微流控芯片Edman降解系统

3.2.3.外界和芯片的接口(“World to chip”interface)

3.2.4.TMA与TFA的气体的传输

3.2.5.Edman降解反应步骤

3.2.6.质谱测试

3.2.7.序列测定方法

3.3.结果与讨论

3.3.1.切割方法对灵敏度的影响

3.3.2.微流控芯片Edman降解法的灵敏度

3.3.3.实际样品的分析

3.4.结论

参考文献

第四章芯片Edman降解在从头测序法中的应用研究

4.1.前言

4.2.实验部分

4.2.1.试剂及材料

4.2.2.Edman降解

4.2.3.质谱测试

4.3.结果与讨论

4.3.1.不同系列离子的辨别方法

4.3.2.合成多肽的测试

4.3.3.C端修饰神经多肽的测试

4.3.4.利用b2离子作为内标提高质量测定精度研究

4.4.结论

参考文献

第五章微流控芯片蛋白质测序仪的初步研究

5.1.前言

5.2.实验部分

5.2.1.试剂

5.2.2.芯片设计与制作

5.2.3.反应柱填充及更换

5.2.4.样品的加载

5.2.5.实验装置及组装

5.2.6.降解流程

5.2.7.洗脱

5.2.8.质谱测试

5.3.结果与讨论

5.3.1.SIA系统流路及芯片的设计

5.3.2.样品加载

5.3.3.降解程序的设计

5.3.4.“Chip to MALDI”接口

5.3.5.样品的分析与测试

5.4.结论

参考文献

附录　攻读博士学位期间完成的论文和工作

致谢