锌对大鼠肝脏硬脂酰辅酶A去饱和酶-1(SCD-1)的影响及其调控机理研究

摘要

本文系统研究了日粮缺锌与高锌对SD大鼠生长发育及肝脏基因表达谱的影响，发现日粮锌可影响硬脂酰辅酶A去饱和酶及其转录调控因子的基因表达；并进一步通过短期锌注射试验，检测了血清脂蛋白、甘油三酯、胆固醇、血浆激素、肝脏和血浆脂肪酸组成、SCD-1及其相关转录调控因子的mRNA水平，探讨了锌对硬脂酰去辅酶A去饱和酶的转录调控机理；利用原代肝细胞培养技术，明确了锌对SCD-1的转录调控途径。主要研究内容和结果如下：
　　 1.锌对SD大鼠生长性能与体内锌水平的影响
　　 选用体重为90±5 g雄性SD大鼠100只，经3天适应性喂养后随机分为4组，分别为缺锌组、配饲组、正常锌组和高锌组。每组25只大鼠，分笼饲养，每笼5只，于屏障系统中饲养5周，每天记录采食量，每周称重一次。饲养结束后，屠宰并解剖取样分析。结果表明，①饲喂缺锌日粮的大鼠表现出典型的缺锌症状，即精神萎靡、活动量减少、食欲不振、毛发紊乱无光泽、角质化严重甚至脱毛等症状，与配饲组相比体格明显瘦小；而饲喂高锌日粮的大鼠精神状况良好，采食行为正常，毛发柔顺光亮，且个体大于正常组。②与PF组相比，ZD组大鼠的体重、器官重量、体内锌水平和碱性磷酸酶活性均显著降低；与ZA组相比，ZO组大鼠的体重、器官重量、锌水平和ALP活性均显著增加。
　　 2.锌对肝脏基因表达谱的影响
　　 采用表达谱基因芯片技术，发现了缺锌和高锌均能影响SD大鼠肝脏基因表达谱。对芯片中差异表达基因进行聚类分析表明，缺锌组中有68个基因的表达水平发生了显著变化，高锌组有76个基因发生了显著差异表达。这些差异表达基因的产物参与机体脂肪代谢、氮代谢、碳水化合物代谢、离子转运、DNA转录与翻译、免疫和信号转导等功能。进一步筛选发现，低锌使SCD-1 mRNA水平显著降低，而高锌并未使之发生显著改变；缺锌使过氧化物酶体活化受体α和甲状腺激素受体mRNA水平显著下调，而高锌使二者mRNA水平均上调。
　　 3.锌调控脂肪酸组成和SCD-1转录的机理
　　 以注射氯化锂作为不良反应的阳性对照，研究了SD大鼠对腹腔注射锌的适应性反应，确定了不会引起动物产生不良反应的注射剂量，从而排除了因不良反应而影响机体正常生理功能的可能性。通过饲喂缺锌和正常锌日粮建立了两种内源锌水平不同的大鼠模型。在此基础上，试验设2个因子，其中因子A为注射锌：设4个水平，其单位活体重注射浓度分别为0、0.5、1.0和2.0μg/g；因子B为大鼠模型，分别为大鼠体内正常锌和缺锌2个水平，分别以ZA和ZD表示。试验共计8个处理，每个处理设5个重复。研究了注射锌和内源锌对SD大鼠血清脂蛋白、总胆固醇、血糖、血浆激素、肝脏与血浆脂肪酸组成、SCD-1及其转录调控因子基因表达的影响，并分析了各个指标之间的相关性。主要结果如下：
　　 3.1大鼠对腹腔注射锌的适应性反应
　　 与纯净水消耗量相比，注射LiCl组的大鼠对0.1％糖精水消耗量显著减少，显示出不良反应；注射Zn和Zn组的大鼠对0.1％糖精水的消耗量与注射生理盐水组差异均不显著，而注射Zn组大鼠出现严重的不适反应甚至死亡，这表明注射剂量为2.0μg/g及以下水平的Zn均不会使大鼠产生不良反应。
　　 3.2缺锌和正常锌大鼠模型的建立
　　 饲喂缺锌日粮的大鼠表现出缺锌的典型症状。缺锌组的血清、肝脏、股骨和骨骼肌锌水平较正常锌组分别降低27.43％、15.39％、31.15％和27.30％(P〈0.05)。正常组大鼠毛发有光泽、采食和其他行为能力都正常。结果表明，已成功构建了缺锌和正常锌两种内源锌水平不同的大鼠模型。
　　 3.3注射锌的效应：以A(0)组为对照组
　　 (1)锌对血清脂蛋白、总胆固醇和血糖等指标的影响：注射锌使ZA模型大鼠高密度脂蛋白和总胆固醇与ZD模型中的葡萄糖水平均显著提高，而使肝脏游离脂肪酸水平明显降低；注射剂量为2.0μg/g时，ZA模型中低密度脂蛋白和血糖与ZD模型中甘油三酯浓度均显著提高。
　　 (2)锌对血浆激素的影响：
　　 在ZA模型下，注射锌使血浆胰岛素和胰高血糖素水平显著上升，而使T4和leptin水平显著降低；在ZD模型中，腹腔注射锌增加IRI、T3、T4和leptin水平，但减少PG水平。
　　 (3)锌对肝脏脂肪酸组成的影响：
　　 在ZA模型中，A组的C16:0与C18:1含量和C18:1/C18:0比值显著降低,C16:1含量和C16:1/C16:0比值则显著升高；A(1)和A(2)中C16:0、C16:1、C18:0含量和C16:1/C16:0比值均显著提高，而C18:1含量和C18:1/C18:0比值则显著降低。在ZD模型中，A(0.5)和A(1)组的C16:0、C16:1和C18:0含量均显著升高,C18:1含量和C18:1/C18:0比值则显著降低；A(2)中C18:0和C18:1含量与C18:1/C18:0比值都显著降低。
　　 (4)锌对血浆脂肪酸组成的影响：
　　 (5)锌对肝脏硬脂酰辅酶A去饱和酶及其调控因子mRNA水平的影响：
　　 在ZA模型中，注射锌均可使肝脏硬脂酰辅酶A去饱和酶-1和固醇调节元件结合蛋白-1cmRNA水平显著增加；同时，注射剂量为1.0和2.0μg/g还可使PPARα mRNA水平显著增加，而TRβ mRNA水平在注射剂量为0.5和2.0μg/g时也有显著增加。在ZD模型下，注射剂量为2.0μg/g均可使SCD-1 mRNA水平显著增加；注射剂量为1.0和2.0μg/g均可使PPARα和SREBP-1c mRNA水平显著增加；注射剂量为0.5μg/g使TRβ mRNA水平显著降低。
　　 3.4体内缺锌和正常锌模型效应：
　　 以ZA组为对照组，内源缺锌使LDL、HDL、TG、TC、肝脏FFA、IRI、T3和T4水平均显著降低，但对PG和leptin水平均无明显影响；同时，内源缺锌还显著降低肝脏中C16:1含量和C16:1/C16:0比值与血浆中C18:0和C18:1含量，增加肝脏C18:1含量；缺锌大鼠中SCD-1和TRβ mRNA水平均显著降低。
　　 3.5相关性分析：
　　 (1)肝脏脂肪酸组成与生化指标之间的相关性分析：
　　 C16:0含量只与T3呈正相关； C16:1含量分别与LDL、HDL、TC、PG、T3、 IRI和Leptin呈正相关；C16:1/C16:0比值与LDL、HDL、TC、TG、PG、T3、IRI和Leptin都呈正相关(P〈0.05)；C18:0含量只与HDL呈正相关； C18:1脂肪酸与LDL、HDL、TC、PG、IRI和Leptin均呈负相关; C18:1/C18:0比值与LDL、HDL、TC和IRI呈负相关。
　　 (2)肝脏脂肪酸组成与SCD-1及其调控因子表达水平之间的相关性分析：
　　 SCD-1 mRNA水平与C16:1和C16:1/C16:0比值呈正相关，而与C18:1和C18:1/C18:0比值呈负相关； PPARα mRNA水平与肝脏脂肪酸组成均无相关性； TRβ与C16:0和C18:1含量呈负相关，但是与C16:1/C16:0比值呈正相关；SREBP-1c mRNA水平与C18:1和C18:1/C18:0比值呈负相关，而与C16:1/C16:0比值呈正相关。
　　 (3)血浆脂肪酸组成与生化指标之间的相关性分析：TG与C18:1呈负相关(P〈0.05)，与C18:1/ C18:0比值呈正相关； T3与C16:1/C16:0比值呈负相关，与C18:0含量呈正相关； T4与C16:1含、C16:1/C16:0和C18:1/C18:0比值呈负相关，与C18:0含量呈正相关； IRI与C16∶0、C18:0含量和C16:1/C16:0比值呈负相关；leptin与C18:0含量呈正相关，而与C18:1/C18:0比值呈负相关。
　　 (4)血浆脂肪酸组成与SCD-1及其调控因子表达水平之间的相关性分析：
　　 C16:1含量与肝脏SCD-1和SREBP-1c mRNA水平呈正相关；C18∶1含量与TRβ mRNA水平呈负相关；C18:1/C18:0比值与SCD-1和SREBP-1c mRNA水平呈负相关。
　　 (5)激素与SCD-1及其调控因子表达水平之间的相关性分析：
　　 SCD-1 mRNA水平与PG、IRI、T3和T4呈正相关；TRβ mRNA水平与PG和T3呈正相关；SREBP-1c则只与IRI呈正相关。
　　 4.锌调控原代肝细胞中SCD-1转录的机理
　　 以缺锌大鼠的原代肝细胞为材料，发现400μM二乙烯三胺五乙酸使SREBP-1c mRNA水平显著降低，而PPARα mRNA水平明显上调；DTPA浓度为600μM时，SCD-1、TRβ、SREBP-1c和PPARα mRNA水平均显著降低。以正常锌大鼠的原代肝细胞为材料，发现锌(均使SREBP-1c mRNA水平明显升高；除锌浓度为100μM组外，其他锌水平均使SCD-1和TRβ mRNA水平显著升高；其中锌浓度为50μM时，SCD-1基因表达水平为最高。相关性分析发现，SCD-1 mRNA水平分别与TRβ和SREBP-1c转录丰度呈正相关。

目录

文摘

英文文摘

致谢

主要英文缩写词

引言

第一章 文献综述

第一节 锌的生物学功能及其在动物营养中的作用

1 锌在动物体内的分布

2 锌的吸收、转运与代谢

3 锌的生物学功能

4 有机锌和无机锌的生物学效价

5 锌的缺乏与过量

6 高锌的应用

第二节 锌在动物脂肪酸去饱和中的调控作用

1 缺锌和脂肪酸A5和A6去饱和

2 缺锌与脂肪酸A9去饱和

3 缺锌对多饱和脂肪酸与磷脂脂肪酸结合的影响

4 缺锌对红细胞膜脂肪酸组成的影响

第三节 SCD-1在脂质代谢中的作用及其基因表达调控

1 SCD基因表达的组织特异性

2 SCD-1在脂质代谢中的作用

3 SCD-1基因转录调控

第四节 分子生物学技术与细胞培养技术在动物营养学研究中的应用

1 表达谱基因芯片

2．实时荧光定量PCR

3．肝细胞原代培养技术

第二章 研究报告

第一节 日粮锌水平对大鼠生长性能和肝脏基因表达谱的影响

试验一 不同锌水平对SD大鼠生长性能和机体锌含量的影响

试验二 日粮锌水平对SD大鼠肝脏基因表达谱的影响

第二节 短期注射锌对大鼠脂肪酸组成和SCD-1的影响及其作用机理

试验一 SD大鼠对腹腔注射锌适应性反应

试验二 锌对大鼠生化代谢、脂肪酸组成和SCD-1及其调控因子基因表达的影响

第三节 锌诱导大鼠原代肝细胞SCD-1基因表达的调控机理

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 主要结论、创新点及后续研究展望

参考文献

附录 pUCm-T vector图谱

个人简历和主要发表及录用的论文