脐带血造血干/祖细胞体外扩增制剂及其临床前安全性检测分析

摘要

造血干细胞移植(HSCT)可用来治疗多种恶性血液系统疾病。脐血是除骨髓、外周血之外又一极具有潜力的造血干/祖细胞(hematopoieticstem/progenitor cells,HS/PCs)来源,在组织工程、细胞移植、基因治疗等领域的应用前景十分广阔。HSCT成功植入的先决条件之一是必须输入足够量的造血干/祖细胞(HS/PCs)。细胞剂量过少会导致植入时间延长,移植失败的可能性增大。目前直接提取的造血干细胞不能满足体重大于20Kg的成体移植的需要。所以造血干细胞需要进行体外扩增。关于体外扩增的研究热点之一是如何对造血干/祖细胞进行有效扩增,同时又尽可能调节增殖和分化之间的平衡,既保持干/祖细胞的性能,又能在移植中产生体内快速植入的功效。目前在这方面已取得了一定的成果。许多研究者利用各种细胞因子联合滋养层细胞体外扩增造血干细胞,能够使造血干细胞大量扩增来满足临床移植的需要同时能够保持干/祖细胞的性能。但是扩增出的细胞要是被制成细胞制品应用于临床还是遇到一些问题,比如细胞制品本身的污染,细胞制品可能会携带病毒,各种添加物质的残留量等都会对移植的病人产生移植危险。所以细胞制品需要经过各种检验,来确定是否可以应用于临床。 本实验利用人骨髓间充质干细胞作为滋养层细胞,联合细胞因子组合来扩增脐带血单个核细胞,将扩增的脐带血单个核细胞以5×107/5ml重新悬浮于含有10％DMSO的L-15培养基中,制备成造血干/祖细胞制品。然后对该细胞制品进行细菌、真菌、支原体和外源病毒因子感染以及牛血清残留量、干细胞因子残留量、急性毒性及致瘤性等检测分析,论证该造血干/祖细胞制品临床应用前的安全性。 利用密度为1.077g/ml的Ficoll分离液从人脐血中分离单个核细胞。然后将细胞以2×106/ml的密度种植于含有细胞因子组合(SCF+G-CSF+TPO)以及铺有骨髓间充质干细胞为滋养层细胞的IMDM培养基中,使脐血造血干/祖细胞体外扩增75.2倍,CD34+细胞扩增33.4倍。扩增培养后的粒细胞集落形成单位为扩增之前的3.3倍,扩增培养后的红细胞集落形成单位为扩增之前的4.7倍。经细胞定量制备造血干/祖细胞制品后,对细胞制剂进行无菌等检测以及细胞制剂中细菌内毒素、牛血清残留量和干细胞因子残留量分析。通过上述多批次的检测分析,未发现细胞制剂被细菌、真菌、支原体污染；细菌内毒素的含量没有超过限值。牛血清残留量为18.2ng/ml,符合WHO的规定；干细胞因子残留量为75pg/ml。将细胞制品移植入小鼠体内进行急性毒性和致瘤性试验,裸鼠没有死亡,试验结束剖检所有裸鼠未见肉眼可见的脏器病理改变；小鼠体内移植未发现有致瘤性。这些检测为扩增的造血干/祖细胞制剂将来服务临床需要、辅助治疗血液系统疾病如再生障碍性贫血以及遗传性贫血重建造血功能提供了一定的实验依据。

目录

英文文摘

前言

文献综述 滋养层细胞与造血干细胞共培养的研究进展

摘要

英文文摘

前言

一、体外扩增的方法

1.添加细胞因子对造血干细胞的扩增作用

2.基质细胞对造血干细胞的扩增作用

3.基质细胞联合细胞因子对造血干细胞的扩增作用。

二、研究进展及展望

三、参考文献

一、材料和方法

1.实验材料

2、实验方法

2.1细胞培养和分析

2.2临床前安全因子检测

2.3细胞制品的急性毒理与致瘤性检测

二、结果

1.细胞培养

1.1细胞生长动态

1.2细胞体外扩增倍数

1.3细胞表面抗原分析

1.4集落形成能力测定

2临床前安全性检测

2.1无菌检测

2.2外源病毒因子检测

2.3细菌内毒素检测

2.4 hSCF残留量

2.5牛血清残留量测定

3细胞制品急性毒理性和致瘤性检测结果

3.1细胞制品急性毒理性结果

3.2细胞制品致瘤性结果

三、讨论

四、参考文献

致谢

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