柱撑处理对蒙脱石纳米微粒吸附霉菌毒素的影响研究

摘要

本课题应用纳米技术,构建了蒙脱石纳米微粒MN、CTAB-柱撑蒙脱石纳米微粒CMN和Al2O3-柱撑蒙脱石纳米微粒AMN,并对其进行表征。以MN作为对照,系统地研究了柱撑后的CMN和AMN对玉米赤霉烯酮(ZEA)、赭曲霉毒素A(OTA)和黄曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)的吸附效果及吸附稳定性和选择性；同时,运用Caco-2细胞模型考察了CMN、AMN和上述六种霉菌毒素对Caco-2细胞的增殖毒性以及CMN和AMN通过吸附对其在Caco-2细胞模型中跨膜转运的影响。
　　 主要研究结果如下：
　　 1. 柱撑蒙脱石纳米微粒的构建与表征 以钠基蒙脱石、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、AlCl3•6H2O为主要原料,应用纳米科技,构建出蒙脱石纳米微粒MN、柱撑蒙脱石纳米微粒CMN和AMN,比较研究了MN、CMN和AMN的粒径大小和晶体结构。 经原子力显微镜分析,CMN和AMN的粒径均小于100nm,经X衍射谱线和红外光谱分析,CTAB和Keggin铝离子以离子交换的方式进入蒙脱石结构单元层间,后者再经500℃高温煅烧后,在蒙脱石层间形成Al203氧化物柱。与MN相比,CMN和AMN经柱撑后doo1层间距增大,分别增加了0.628nm和0.246nm；粒径变小,分别降低了24.77nm和20.56nm。 CMN和AMN在分别吸附了ZEA、OTA和AFB1后,形成吸附剂-霉菌毒素复合物,再进行XRD和FTIR分析。XRD分析结果显示,CMN在吸附了ZEA、OTA和AFB1后,其doo1层间距分别增加了0.057nm、0.066nm和0.066nm；AMN在吸附了ZEA、OTA和AFB1后,其doo1层间距分别增加了0.005nm、0.036nm和0.02nm。XRD结果表明,CMN比AMN表现出更优异的吸附性能与霉菌毒素分子能够大量进入其层间有关。FTIR分析显示,CMN和AMN在吸附霉菌毒素分子时,其层间的烷基碳链、Al2O3中的氧原子、霉菌毒素分子结构中的羰基氧原子和不饱和碳-碳双键及碳-氧双键均不同程度地参与其中。
　　 2. 柱撑蒙脱石纳米微粒对霉菌毒素的吸附研究 从吸附时间、吸附剂用量、溶液pH、吸附温度、振荡速度以及起始浓度等方面研究了CMN和AMN在体外水相溶液中对ZEA、OTA、AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的吸附效果,同时也考察了CMN和AMN对它们的吸附稳定性和选择性。结果显示,经过柱撑的CMN和AMN对上述六种霉菌毒素均表现出优异的吸附效果,根据Freundlich等温方程,CMN和AMN对ZEA、OTA、AFB1、AFB2AFG1、AFG2的饱和吸附容量分别达到了1830.21μg/g和1034.90μg/g(P0.05)、3663.53μg/g和2466.61μg/g(P0.05)、3112.43μg/g和2087.37μg/g(P0.05)、1479.79μg/g和1210.60μg/g(P0.05)、1882.35μg/g和523.72μg/g(P0.05)、975.89μg/g和905.94μg/g(P0.05)；根据Langmuir等温方程,ZEA、OTA、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2在CMN和AMN上的饱和吸附容量分别达到了1250.00μg/g和1428.57μg/g(P0.05)、1111.11μg/g和1250.00μg/g(P0.05)、1428.57μg/g和1666.67(P0.05)、1111.11μg/g和1111.11μg/g、1250.00μg/g和1250.00μg/g、1000.00μg/g和1111.11μg/g(P0.05)；而未经柱撑处理的MN的饱和吸附容量根据Freundlich和Langmuir等温方程分别达到了199.34μg/g和555.56μg/g、149.14μg/g和333.33μg/g、1666.67μg/g和1100.27μg/、393.01μg/g和2500.00μg/g、714.29μg/g和258.64.00μg/g、250.09μg/g和1000.00μg/g。与MN相比,有机或无机柱撑均使CMN和AMN对六种霉菌毒素的饱和吸附容量显著提高(P0.05)。 吸附稳定性和选择性研究结果显示,CMN和AMN对上述六种霉菌毒素均具有很强的吸附稳定性和选择性,属于化学吸附,解吸率均在6.0-20.0％范围内,赖氨酸、蛋氨酸、维生素B1、维生素B2、Ca2+和Fe2+等主要饲料养分均未对霉菌毒素的吸附产生显著影响(P0.05)。CMN和AMN对六种霉菌毒素的吸附速度快,60分钟内即可达到平衡；pH降低和温度升高均有促进其吸附霉菌毒素的趋势(P0.05)。
　　 3. 柱撑蒙脱石纳米微粒和霉菌毒素对Caco-2细胞增殖的影响 采用体外细胞培养技术,以Caco-2为评价细胞系,通过MTT法研究了CMN、AMN、ZEA、OTA、AFB1、AFB2、AFG1和AFG2对Caco-2细胞增殖的影响,同时也考察了添加不同剂量的CMN或AMN对霉菌毒素损伤Caco-2细胞的影响。 结果显示：在霉菌毒素添加剂量为250ng/ml、500ng/ml、750ng/ml、1000ng/ml和暴露时间为12h、24h、36h、48h的情况下,六种霉菌毒素均显著降低了Caco-2的相对存活率,在较低浓度和较短的暴露时间里,其对Caco-2细胞的增殖毒性具有明显的量效关系。 在CMN和AMN的添加剂量为0.25％、0.5％、0.75％、1.0％和暴露时间为24h、48h、72h的情况下,Caco-2的相对存活率均在88.76％以上；毒性评级结果显示,CMN和AMN对Caco-2的毒性级别仅为1级,符合中华人民共和国国家标准对人体植入材料的细胞毒性不大于1级的规定,可以用于霉菌毒素在Caco-2细胞模型的转运研究。 在六种霉菌毒素浓度均为900 ng/ml的细胞培养液中,依次添加质量百分比浓度为0.25％、0.5％、0.75％和1.0％的CMN和AMN,暴露时间为48h，CMN和AMN均能在各个添加剂量显著提高Caco-2的相对存活率(P0.05)。与添加ZEA的阳性对照相比,二者在不同添加剂量对Caco-2细胞相对存活率的提高幅度分别达到95.2％、101.9％、103.4％、104.8％和55.1％、62.1％、65.6％、72.5％；与添加OTA的阳性对照相比,二者对Caco-2细胞相对存活率的提高幅度分别达到123.9％、137.3％、142.5％、145.4％和80.2％、88.9％、95.0％、104.3％；与添加AFB1的阳性对照相比,二者对Caco-2细胞相对存活率的提高幅度分别达到865.7％、902.5％、917.4％、942.8％和646.5％、680.6％、700.8％、770.0％。与添加AFB2的阳性对照相比,二者对Caco-2细胞相对存活率的提高幅度分别达到716.5％、746.4％、761.7％、771.2％和602.5％、617.9％、640.5％、670.4％。与添加AFG1的阳性对照相比,二者对Caco-2细胞相对存活率的提高幅度分别达到796.4％、833.5％、843.2％、860.9％,和640.6％、600.0％、708.5％、739.1％。与添加AFG2的阳性对照相比,二者对Caco-2细胞相对存活率的提高幅度分别达到605.4％、617.3％、634.7％、646.6％和508.5％、521.6％、537.4％、564.1％。 结果显示,在处于高水平霉菌毒素暴露的环境下,CMN和AMN通过吸附霉菌毒素均能有效降低其对Caco-2细胞的损伤。
　　 4. 柱撑蒙脱石纳米微粒对霉菌毒素在Caco-2细胞模型中转运的影响 应用Caco-2细胞吸收模型,研究了CMN和AMN在模拟消化道环境中对六种霉菌毒素跨膜转运的影响。试验组AP侧六种霉菌毒素的浓度均为900 ng/ml,CMN和AMN的质量百分比浓度均为0.25％,37℃培养3h,从Caco-2细胞模型的BL侧移取200μl样品液进行HPLC分析,计算各霉菌毒素的跨膜转运率。
　　结果显示：与对照组相比,CMN分别使ZEA、OTA、AFB1、AFB2、AFG1和AFG2在Caco-2细胞单层中的转运率下降了90.78％、93.68％、91.37％、87.95％、90.72％和87.48％(P0.05),AMN则分别使之降低了85.34％、88.87％、84.09％、83.74％、87.55％和82.43％(P0.05)；与AMN相比，CMN也显著降低了六种霉菌毒素在Caco-2细胞模型中的跨膜转运率,降低幅度依次为37.14％、43.21％、45.78％、25.90％、25.50％和28.69％(P0.05)。

目录

文摘

英文文摘

致谢

主要缩略词

引言

第一章 文献综述

第一节 饲料和食品中的霉菌毒素

1 常见霉菌毒素的种类

2 常见霉菌毒素的限量标准

3 霉菌毒素对畜禽的危害

4 霉菌毒素的脱毒或解毒措施

5 小结

第二节 纳米技术在动物科学中的研究与应用现状

1 纳米材料吸附剂

2 纳米抗菌药物

3 纳米微量元素添加剂

4 小结

第二节 Caco-2细胞模型及其在霉菌毒素研究中的应用

1 Caco-2细胞模型的构建

2 Caco-2细胞模型在外源化学毒物研究中的应用

3 小结

第二章 柱撑蒙脱石纳米微粒的构建与表征

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 粒径分析

1.3 晶体结构

2 结果与讨论

2.1 粒径分析

2.2 X射线衍射

2.3 红外光谱

3 小结

第三章 柱撑蒙脱石纳米微粒对霉菌毒素的体外吸附研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.3 试验数据统计分析

2 试验结果

2.1 吸附等温方程

2.2 pH对霉菌毒素吸附的影响

2.3 吸附剂用量对霉菌毒素吸附的影响

2.4 温度对霉菌毒素吸附的影响

2.5 时间对霉菌毒素吸附的影响

2.6 振荡速度对霉菌毒素吸附的影响

2.7 起始浓度对霉菌毒素吸附的影响

2.8 吸附的稳定性

2.9 吸附的选择性

3 讨论

3.1 饱和吸附容量

3.2 pH对霉菌毒素吸附的影响

3.3 吸附剂用量对霉菌毒素吸附的影响

3.4 温度对霉菌毒素吸附的影响

3.5 时间对霉菌毒素吸附的影响

3.6 振荡速度对霉菌毒素吸附的影响

3.7 起始浓度对霉菌毒素吸附的影响

3.8 吸附的稳定性

3.9 吸附的选择性

4 小结

第四章 柱撑蒙脱石纳米微粒和霉菌毒素对Caco-2细胞的影响

1 材料与方法

1.1 试验仪器与材料

1.2 细胞培养条件及方法

1.3 霉菌毒素对Caco-2细胞的影响

1.4 柱撑蒙脱石纳米微粒对Caco-2细胞的影响

1.5 柱撑蒙脱石纳米微粒吸附霉菌毒素对Caco-2细胞的影响

1.6 MTT检测

1.7 细胞毒性的评价指标

1.8 统计分析

2 试验结果

2.1 霉菌毒素对Caco-2细胞的影响

2.2 柱撑蒙脱石纳米微粒对Caco-2细胞的影响

2.3 柱撑蒙脱石纳米微粒吸附霉菌毒素对Caco-2细胞的影响

3 讨论

4 小结

第五章 柱撑蒙脱石纳米微粒对霉菌毒素在Caco-2细胞模型中转运的影响

1 材料与方法

1.1 试验仪器与材料

1.2 方法

1.3 统计分析

2 试验结果

2.1 跨膜电阻值

2.2 细胞形态

2.3 CMN和AMN对ZEA转运的影响

2.4 CMN和AMN对OTA转运的影响

2.5 CMN和AMN对AFB1转运的影响

2.6 CMN和AMN对AFB2转运的影响

2.7 CMN和AMN对AFG1转运的影响

2.8 CMN和AMN对AFG2转运的影响

3 讨论

4 小结

第六章 提示、创新点及研究展望

提示

创新点

研究展望

参考文献

作者简历及在读期间取得的科研成果