碲化镉量子点对人脐静脉内皮细胞DNA损伤及其机制的研究

摘要

量子点(QDs)又称半导体纳米晶，具有独特的光学和电学特性，越来越广泛地被应用于生物成像及电子工业等领域中。它们在这些领域的应用带来了巨大的经济效益，同时也产生了生物安全性与环境安全性等问题。一些体内研究显示，QDs可以系统地分布并累积于生物体组织器官内。一些研究结果显示QDs可以影响细胞的生长及活力，同时还可引起细胞线粒体及DNA的损伤。其损伤机制尚无定论，研究较多的是氧化应激机制。QDs的生物安全性研究目前刚刚起步，其心血管毒性方面的研究尚未见系统报道。 心血管疾病是严重威胁人类健康和生命的重大疾病，而空气细微颗粒物与心血管疾病之间的密切关系已得到证实，因此包括QDs在内的纳米颗粒的心血管毒性格外引人注目。血管内皮细胞为覆盖于血管内膜表面的单层扁平或多角形的细胞，它的损伤与功能紊乱和多种疾病的发生有密切的关系。研究QDs对血管内皮细胞的损伤及其机制对了解QDs在心血管疾病方面的危害有着积极的意义。 研究显示，细胞DNA受损尤其是DNA双链断裂(DSBs)时，在DSBs位点会出现磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)，它募集许多与染色体结构的维持、保护、修复相关的蛋白质有序地在DNA损伤位点结合，形成焦点(foci)复合物，共同完成对DNA损伤的检测并进行修复。近年来γH2AX已经成为检测细胞DNA损伤的一个新的特异性指标。因此我们使用,／H2AX抗体识别技术检测QDs对HUVEC细胞的DNA损伤作用，观察QDs的遗传毒性。 众所周知，过量的活性氧(ROS)不但可以导致DNA损伤，且与内皮细胞的损伤及功能紊乱有着密切的关系。而诱导ROS的产生似乎是纳米颗粒的一个共性。一些体外研究也显示QDs可以在一些细胞中诱导ROS的产生。因此我们还观察了QDs处理对HUVEC细胞ROS水平的影响。 总之，本研究通过观察CdTe-MPA QDs对HUVEC细胞活力、DNA损伤作用和ROS水平的影响，为评价QDs的潜在心血管毒性及其作用机制提供实验依据。 方法: 1.先用激光共聚焦显微镜观察10 μg/ma CdTe-MPA QDs作用12 h后，HUVEC细胞对QDs的摄取情况；后使用流式细胞术对其进行定量检测。 2.用MTT比色法观察不同浓度QDs(1，5，10，20，50μg/ml)作用12 h后HUVEC细胞的生存情况，计算细胞存活率，并设定本实验剂量。 3.分别用免疫荧光技术和流式细胞技术对QDs(1，10，50μg/ml)处理HUVEC细胞12 h后?γH2AX焦点形成情况进行定性和定量的检测。 4.用化学荧光法检测1)QDs(1，10，50 μg/ml)处理HUVEC细胞2 h后细胞内的ROS水平；2)QDs(10μg/ml)作用1，2，4，6，8 h后HUVEC细胞内ROS水平。 5.NAC(6 mM)预处理后，用化学荧光法检测1)QDs(1，10，50 μg/ml)处理HUVEC细胞2 h后细胞内的ROS水平；2)QDs(50μg/ml)处理HUVEC细胞2，6，12，24 h后细胞内的ROS水平。 6.NAC(6 mM)预处理后，用免疫荧光技术对QDs(50 μg/ml)处理HUVEC细胞6 h后γH2AX焦点形成情况进行定性和半定量的检测。 结果: 1.10 μg/ml QDs作用12h后可以进入HUVEC细胞，并且随着剂量的增加，进入细胞的QDs逐渐增多。 2.MTT结果显示1，5，10，20，50μg/ml QDs作用下细胞的生存率均在70％以上，随着剂量的增高，细胞生存率逐渐降低，50μg/ml QDs作用下细胞的生存率最低，为70.3％。 3.免疫荧光结果显示1，10，50 μg/ml QDs处理12 h后，可诱导HUVEC细胞内γH2AX焦点形成，与空白对照相比具有显著性差异。且随着QDs浓度的增加，γH2AX焦点形成的数量及强度也逐渐增多、增强，各剂量组之间比较，差异具有统计学意义。流式细胞术进行定量检测后显示，1，10，50μg/mlQDs处理12 h后，阳性细胞率分别为6.5％，14.1％，28.0％，随着处理浓度的增高而增大，与空白对照组相比具有显著性差异，趋势与免疫荧光结果一致。 4.ROS检测结果：1)10μg/ml QDs作用不同时间后，发现作用2h，ROS水平显著升高，与对照组比较有显著性差异。2)检测不同剂量QDs处理2 h后的：ROS水平，显示10和50 μg/ml QDs能引起细胞ROS水平的显著增高，而1μg/ml QDs对细胞的ROS水平没有明显的影响。 5.NAC(6 mM)预处理1)50μg/ml QDs作用不同时间后显示，各时间点细胞内ROS水平均明显降低，与单纯QDs处理组相比，具有显著性差异；2)QDs作用2h后，各剂量组细胞内ROS水平均明显降低，与单纯QDs处理组相比，具有显著性差异。 6.NAC(6 mM)预处理后，50 μg/ml QDs+NAC处理组γH2AX焦点阳性细胞率及荧光强度明显降低，与单纯QDs处理组相比，具有显著性差异。 结论: 1.CdTe-MPA．QDs(1-50 μg/ml)能进入HUVEC细胞，并降低细胞的存活力。 2.CdTe-MPA QDs可诱导HUVEC细胞产生ROS和DNA损伤。 3.ROS参与了CdTe-MPA QDs对HUVEC细胞的DNA损伤过程。

目录

论文说明：缩略语

摘要

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

047纳米碳管的毒性研究进展

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