大鼠C6胶质瘤细胞系中肿瘤干细胞样细胞的鉴定及其生物学特性的研究

摘要

背景：胶质瘤，尤其是胶质母细胞瘤，恶性程度高，术后复发快，且对放化疗敏感性差，5年生存率仅为20％左右，因而一直是神经外科治疗中最为棘手恶性肿瘤之一。肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)理论的认为，肿瘤细胞中仅有一小部分肿瘤细胞，称为CSC，真正具有自我更新、无限增殖、多向分化潜能等干细胞样特性，它们是肿瘤发生，转移和复发的根源，而肿瘤中的绝大部分细胞不具有上述特性。研究者已经先后从人类髓母细胞瘤与不同级别的胶质瘤中分离得到了脑肿瘤干细胞(brain tumor stem cells，BTSC)，因而CSC理论的提出为我们从一个全新的角度认识胶质瘤发生、发展机制，并进一步开发出靶向治疗措施带来了希望。 目的：1.明确大鼠C6胶质瘤细胞系内是否存在肿瘤干细胞样细胞及其生物学特性。2.比较当今主流的CSC鉴定方法在鉴定分离获得C6肿瘤干细胞样细胞过程中的效果。3.探讨将C6肿瘤干细胞样细胞应用于人类BTSC研究中的前景。 方法：1.应用无血清培养基(DMEM/F-12，添加bFGF，EGF和B27)培养获得悬浮肿瘤克隆球；用有限稀释法在无血清条件下对C6单细胞进行连续克隆培养，检测其自我更新能力；用含血清培养基(DMEM+10％FBS)诱导分化，以免疫荧光和免疫组织化学技术检测C6单细胞克隆多向分化能力以及分化抗原的共表达情况：用含血清培养基扩增后，通过裸鼠致瘤实验检测C6单细胞克隆连续体内致瘤能力。2.将无血清培养获得的C6肿瘤克隆球连续培养于交替的血清/无血清培养基，检测C6系中肿瘤干细胞样细胞的比例是否稳定：流式细胞仪与免疫组织化学检测不同培养条件下CD133阳性细胞和分化细胞的比例。3.应用免疫磁珠分离CD133阳性与阴性细胞；利用Western Blot技术和免疫荧光技术检测分离细胞的纯度：利用BrdUrd染色检测细胞的增殖能力：利用有限稀释单细胞克隆培养，血清培养基诱导分化，以及裸鼠体内种植的方法分别检测CD133阳性与阴性C6细胞的自我更新能力，多向分化能力，以及连续体内致瘤能力。4.将用于流式细胞术获得侧群细胞的Hoechst 33342染料孵育C6细胞不同时间，检测其对C6细胞的毒性作用，同时检测ABCG2的表达；利用单细胞克隆培养的方法检测孵育后C6细胞的自我更新与无限增殖能力。 结果：1.C6细胞系中有>60％的细胞能在无血清培养基中形成悬浮肿瘤克隆球；肿瘤克隆球细胞中，>80％的单细胞克隆具有自我更新能力：能在血清诱导下产生表达神经元与胶质细胞分化标记的子代肿瘤细胞，并且含血清培养基中的贴壁C6细胞具有共表达CD133与GFAP/NSE的现象，而在无血清培养基中的克隆球中该现象很少见：在裸鼠皮下种植后则显示出连续致瘤性。2.无血清中形成的C6悬浮肿瘤克隆球被转移到血清培养基后，能够再次贴壁生长，而随后的血清/无血清交替培养并不影响C6系中能够在无血清培养基中形成悬浮肿瘤克隆球的细胞比例：流式细胞仪与免疫组织化学显示血清培养基中贴壁C6细胞的CD133阳性率为30％左右，而在无血清克隆球中该比例上升到>85％。3.CD133阳性与阴性C6细胞中均含有肿瘤干细胞样细胞，但是前者在细胞增殖能力与致瘤速度等方面显著强于后者，而且两者的克隆球生长方式也存在差异。4.长时间Hoechst 33342染色对于大部分C6细胞具有毒性作用，使其丧失自我更新能力等CSC特性：但是同时也发现存在1％左右的Hoechst 33342阴性、ABCG2阳性的侧群细胞，其仍然保留有CSC的特征。 结论：1.大鼠C6胶质瘤细胞系中存在肿瘤干细胞样细胞，具有与人类原发脑肿瘤中BTSC相似的生物学特点。2.利用无血清悬浮克隆球培养方法所发现的C6细胞中肿瘤干细胞样细胞的比例远高于依赖CD133作为CSC表面标记的鉴定方法(>60％．30％)，而且CD133阴性亚群中同样存在肿瘤干细胞样细胞；Hoeehst 33342的毒性会使无法排出Hoechst 33342的非侧群细胞丧失CSC的特性。3.虽然今后仍然需要努力寻找到一种更为全面而可靠的BTSC鉴定方法，但是考虑到C6系中大部分细胞符合目前对CSC的定义，因此其仍不失为一种用来研究BTSC的经济简便的体外肿瘤模型。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词一览表

声明

第1章前言

第2章材料和方法

2.1实验材料

2.1.1实验细胞与动物

2.1.2实验器材

2.1.3实验试剂

2.1.4实验用液体的配制

2.2实验方法

2.2.1无血清培养获得C6悬浮克隆球

2.2.2有限稀释法制成单细胞悬液和单细胞自我更新能力分析

2.2.3免疫荧光检测血清诱导后培养细胞中分化抗原的表达

2.2.4裸鼠皮下种植检测致瘤能力

2.2.5组织切片免疫组织化学检测

2.2.6种植瘤细胞的体外培养

2.2.7 C6细胞在含血清和无血清培养基中交替培养

2.2.8流式细胞仪检测CD133与GFAP的表达

2.2.9免疫荧光法检测抗原共表达

2.2.10免疫磁珠分选CD133阳性细胞

2.2.11 Western Blot法检测CD133分选纯度

2.2.12免疫荧光及免疫组化检测CD133分选纯度

2.2.13 BrdUrd染色检测增殖能力

2.2.14 Hoechst 33342染料孵育实验

2.2.15免疫荧光检测ABCG2的表达

2.2.16统计学分析

第3章结果

3.1大部分C6细胞具有肿瘤干细胞的特性

3.1.1 C6细胞具有自我更新能力

3.1.2 C6细胞具有多潜能分化能力

3.1.3血清培养基中的C6细胞具有去分化的趋势

3.1.4 C6细胞具有体内致瘤能力

3.1.5裸鼠种植瘤细胞具有与母代C6细胞相似的生物学特性

3.2 C6细胞可以稳定地在两种培养基间转换生长方式

3.2.1 C6细胞生长方式随着培养基改变而转换

3.2.2无血清中的C6悬浮克隆球具有较高的肿瘤干细胞比例

3.3 CD133阴性C6细胞亚群中亦存在肿瘤干细胞样细胞

3.3.1免疫荧光与Western Blot鉴定磁珠分选后的细胞纯度

3.3.2部分CD133阴性细胞具有肿瘤干细胞的特性

3.4 HOECHST 33342染色对C6细胞具有毒性作用

第4章讨论

4.1脑肿瘤干细胞是胶质瘤发生与复发的根源

4.2大鼠C6胶质瘤细胞系中存在肿瘤干细胞样细胞

4.3需要寻找更为全面而可靠的脑肿瘤干细胞鉴定方法

结论

参考文献

脑肿瘤干细胞的研究进展

致谢