鼻咽癌细胞系中肿瘤干细胞样SP细胞的分离鉴定相关研究

摘要

研究背景与目的： 肿瘤组织的异质性已经得到了广泛的认同。近来研究发现肿瘤组织中存在一群具有自我更新以及多向分化等一系列正常干细胞特征的细胞，这群细胞被命名为肿瘤干细胞(cancer stem cells or tumorstem cells，CSCs or TSCs)。目前研究发现，肿瘤干细胞具有很强的致瘤性，对放疗、化疗不敏感，即使大多数肿瘤细胞被消灭，肿瘤干细胞依然能够卷土重来，成为肿瘤复发的重要原因之一。SP细胞(side population cell，SP cell，侧群细胞)是进行骨髓造血干细胞分离时，利用DNA荧光染料Hoechst 33342和流式细胞技术发现的特殊细胞亚群，它们具有自我更新、多向分化能力等一系列干细胞的生物学特征。研究人员们已经在人体多种正常组织和一些实体肿瘤中分离得到了SP细胞，初步阐明了SP细胞的一系列生物学特征。但是迄今为止仍未见到有关人类鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)中SP细胞分离鉴定的报道。 人类鼻咽癌是来源于鼻咽上皮细胞的恶性肿瘤，其病因涉及遗传背景、病毒感染以及生活习惯和生存环境等多种因素。在西欧和北美的高加索人群中鼻咽癌的发生率很低，但在中国南方、东南亚和北非的部分国家却很常见。由于鼻咽癌在中国广东省的发病率位居世界首位，鼻咽癌也有“广东瘤”之称。随着近年来鼻咽癌诊断和治疗手段的发展，患者的5年生存率有了一定提高，但放、化疗无效以及局部淋巴结转移仍然是鼻咽癌患者死亡的主要原因。于是，有必要深入研究鼻咽癌的生物学特性，了解该疾病的发生发展过程。其中肿瘤干细胞研究将有可能成为突破点，为开发特异有效的靶向性治疗方法提供思路，造福于鼻咽癌患者。 研究方法： 将生长状态良好的NPC细胞经DNA荧光染料Hoechst33342染色后进行流式细胞仪无菌分选，分别收集荧光阳性的NSP细胞和荧光阴性的SP细胞观察它们的生长速度、周期分布以及形态差别，并进一步观察它们是否具有干细胞的多种特征，如自我更新、多向分化能力等。将分选后的细胞立即接种到培养板，进行克隆形成实验来反映两个细胞亚群克隆形成能力是否存在差别；并对分选后常规培养一段时间的细胞再次进行Hoechst 33342染色分析SP细胞的比例，观察它们的多向分化能力；提取细胞总RNA进行PF-PCR来检测ABCG2分子RNA水平的表达，用ABCG2单克隆抗体标记后进行流式细胞检测ABCG2蛋白在细胞表面的表达情况。一系列的体外试验后我们进行NOD/SCID小鼠体内成瘤实验，观察两细胞亚群在体内的致瘤能力，这也是证明肿瘤干细胞能力所通用的重要指标之一。 经过以上一系列方法验证了细胞的干细胞特征之后，我们进行放疗和化疗敏感性试验，观察它们的反应性差别，以期为临床应用提供依据，同时，我们探索了可能的相关机制。此外，我们采用免疫荧光染色方法来分析细胞表面角蛋白分子的表达，希望为进一步从SP细胞亚群中分离鉴定肿瘤干细胞提供有效的标记分子。 最后，鉴于目前关于肿瘤干细胞的来源问题仍然没有统一的认识，我们拟采用理化因素诱导的方法来观察分化成熟的终末肿瘤细胞是否可以出现肿瘤干细胞的表型。经过有限稀释接种细胞得到单个细胞克隆并扩大培养后，我们对单细胞克隆进行理化因素诱导，观察处理后的细胞是否可以产生干细胞样表型。首先，我们选用人类鼻咽癌细胞系CNE-2，对来自于该细胞系的NSP表型单细胞克隆进行诱导然后观察SP细胞的比例。此外我们还对人神经母细胞瘤细胞系SK-N-CH细胞来源的CD133-单克隆细胞进行诱导，观察干细胞标记物CD133+表达细胞比例的变化。 结果： 我们发现NPC细胞系CNE-1、CNE-2、C666-1、SUNE-1和HONE-1中均有不同比例SP细胞(0.1﹪～6.8﹪)的存在。针对来源于CNE-2细胞系的SP细胞我们进行了系列研究，发现这些SP细胞具有正常干细胞的一些关键特征。这些SP细胞能够无限增殖，在相同的培养环境中比NSP细胞生长迅速(P<0.001)。与NSP细胞相比，SP细胞还具有较高的克隆形成能力(P<0.001)，能够分化产生NSP细胞并维持自身SP细胞的比例在一个较稳定的水平。从NOD/SCID小鼠体内成瘤实验我们发现，SP细胞具有很强的致瘤能力，10，000个SP细胞就可以形成肿瘤而NSP细胞需要至少200，000细胞才能形成肿瘤，肿瘤形成能力比。NSP细胞高出至少20倍。 SP细胞对化疗药物盐酸米托葸醌、顺铂、丝裂霉素C等都有不同程度的耐受(P<0.001，P<0.05，P<0.05)，研究发现这种广谱的耐药现象与ABCG2分子的表达相关。与NSP细胞相比，SP细胞对放疗不敏感(P<0.05)，但是这种耐受状态可以通过药物Cyclopamine的预处理而得到改善。经过对干细胞相关信号传导通路Sonic Hedgehog(SHH)中重要成员Smo蛋白进行Western Blot分析，我们推测SP细胞的放疗耐受现象与Smo蛋白的表达有关。 通过免疫荧光染色实验我们发现角蛋白分子8和18在SP和NSP细胞上的表达水平相似。角蛋白分子19在SP和NSP细胞中的表达显著低于角蛋白8和18，但是在SP细胞上的表达依然高于NSP细胞(P<0.05)，说明该分子的表达在SP和NSP细胞之间存在一定的差异，可能在进一步分离鉴定鼻咽癌肿瘤干细胞的研究中有一定价值。 克隆诱导实验中，无论是从人鼻咽癌细胞系CNE-2分选得到的NSP细胞或者是筛选出来的NSP单细胞克隆，在经过紫外线以及丝裂霉素C的处理后都不同程度的出现了一小群SP细胞。而来源于人神经母细胞瘤细胞系SK-N-CH的CD133-单细胞克隆经过同样处理后(处理时间和剂量有所调整)，也出现了CD133+的亚群。这些数据表明物理化学因素的诱导将有利于肿瘤干细胞表型的发生和发展，为肿瘤干细胞的肿瘤细胞来源提供了重要依据。 结论： 多种鼻咽癌细胞系中存在着SP细胞亚群。经过对来源于CNE-2细胞系的SP细胞进行细致研究发现该细胞系中SP细胞具有干细胞的特征，包括无限增殖和自我更新能力，高克隆形成能力，多向分化潜能以及在小鼠体内的强致瘤能力等。ABCG2分子的表达是SP细胞具有对多种化疗药物耐受性的可能机制之一。SP细胞对放疗不敏感，研究表明这与SHH信号通路中关键分子Smo分子的表达密切相关。此外，角蛋白19差异表达可以用于进一步分离鉴定肿瘤干细胞，有可能成为鼻咽鳞状上皮肿瘤干细胞特异表达的分子标记。通过克隆诱导实验我们发现，非肿瘤干细胞的肿瘤细胞经过物理化学因素诱导刺激后可以产生具有肿瘤干细胞表型的细胞，从而为肿瘤干细胞的终末肿瘤细胞来源提供了实验依据。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章材料与方法

1.1实验技术路线及研究内容介绍

1.2实验材料以及试剂配制

1.3实验方法

第二章结果

2.1 SP细胞的分选以及干细胞特性研究

2.2细胞表面分子分析，放化和化疗敏感性实验

2.3肿瘤干细胞表型诱导实验

第三章讨论

第四章结论

参考文献

附录1：缩略词表

附录2：在读期间发表的论文

致谢

原创性声明