早期多次卡介苗接种预防哮喘和结核的研究

摘要

第一部分早期多次接种BCG预防哮喘 目的： 新生鼠多次接科BCG，待成年后诱发哮喘，观察早期接种卡介苗对诱导机体Thl、Th2免疫的作用，以及对致敏原激发后气道反应性、嗜酸粒细胞浸润为主的气道炎症以及黏液高分泌的作用； 方法： 选择C57BL/6新生鼠，随机分为早期多次BCG组(BCG3组)、早期单次BCG组(BCG1组)和对照组(saline组)。BCG3组分别在出生0、7、14天予以105CFU BCG行皮下接种3次，BCG1组仅在出生O天予105CFU BCG接种1次，对照组给予等量注射用水。待小鼠8周龄后检测各组脾细胞上清IFN-γ、IL-4水平。随后以卵白蛋白(ovablumin，OVA)进行致敏和激发，建立哮喘小鼠模型。各组小鼠(BCG3+OVA组，BCG1+OVA组，OVA组，saline组)于最后一次抗原激发后48小时检测气道反应性、进行支气管肺泡灌洗液细胞分类计数、肺组织病理切片观察气道炎症和黏液高分泌。 结果： 经BCG接种后，8周龄接种小鼠脾上清IFN-γ高于未接种组。与BCG1组比较，BCG3组IFN-γ水平显著升高，有统计学意义(P<0.05)。BCG3组和BCG1组脾上清IL-4水平与未接种组比较，无明显差别(P>0.05)。各组小鼠经OVA激发后，OVA组小鼠气道反应性、支气管肺泡灌洗液中Eos、肺组织炎症和气道黏液分泌较生理盐水对照组明显增加(P<0.05)。BCG1+OVA组与OVA组相比无显著差异(P>0.05)。BCG3+OVA组气道高反应性较模型组明显减轻(P<0.05)。BCG3+OVA组小鼠未见抑制致敏小鼠抗原攻击后引起的BALF细胞总数的增多，但显著降低了Eos数(P<0.05)。病理学检查结果显示BCG3+OVA组肺组织炎症浸润和黏液高分泌明显降低(P<0.05)。 结论： 新生鼠BCG接种可以诱导机体产生IFN-γ，并维持至成年后。新生鼠多次BCG接种诱导的Th1反应强于新生鼠单次BCG接种。经抗原致敏和激发后，新生鼠多次BCG接种明显抑制成年鼠OVA激发后的AHR、气道Eos炎症及黏液高分泌，而单次BCG接种未能抑制。早期多次BCG接种预防哮喘的机制可能依赖诱导产生的Th1型细胞因子。 第二部分早期多次接种BCG预防结核 目的： 新生鼠多次接种BCG，待成年后予H37Rv攻击建立结核模型，观察：①早期接种BCG对结核模型小鼠一般情况、脾指数、肺和脾组织结核菌增殖、肺病理变化的作用；②Th1和Th2型细胞因子在结核免疫中的作用。 方法： 选择C57BL/6新生鼠，随机分为早期多次BCG组(BCG3组)、早期单次BCG组(BCG1组)和对照组(saline组)。BCG3组分别在出生0、7、14天予以105CFU BCG行皮下接种3次，BCG1组仅在出生0天予105CFU BCG接种1次，对照组给予等量注射用水。H37Rv攻击前，检测各组脾细胞上清IFN-γ、IL-4水平。待小鼠满8周龄后以2.5x106 CFU H37Rv予尾静脉注射，建立结核小鼠模型。观察各组小鼠(BCG3+H37Rv组，BCG1+H37Rv组，H37Rv组，saline组)一般情况和生存情况，并选择在H37Rv攻击后3周、6周和9周收集标本，分别检测脾指数、肺和肝组织结核菌增殖和肺组织病理变化情况。同时检测这三个时间点小鼠脾细胞上清IFN-γ、IL-4水平和分泌IFN-γ的淋巴细胞频率，并进一步检测外周血IFN-γ、IL-12、IL-2和TNF-α水平。 结果： 各组小鼠经H37Rv攻击后3周，与H37Rv组小鼠比较，两组BCG组均显示对结核有抑制作用。与H37Rv组比较，BCG3+H37Rv组中脾指数显著降低(P<0.05)，而BCG1+H37Rv组脾指数无显著下降(P>0.05)。BCG3+H37Rv组和BCG1+H37Rv组均显著降低肺、肝的结核菌负荷量和肺组织病变，其中，BCG3+H37Rv组肺组织中结核菌负荷量和肺组织病变严重程度均较BCG1+H37Rv组低，两组比较有统计学差别(P<0.05)。至H37Rv攻击后6周，2组BCG干预组脾指数与H37Rv组比较无显著性差别(P>0.05)。两组BCG组均仍显示肺、肝结核菌负荷明显低于H37Rv组(P<0.05)。但BCG3+H37Rv组和BCG1+H37Rv组比较无统计学差别(P>0.05)。肺组织病理显示2组BCG干预组病变进展，但累及范围仍明显小于H37Rv组。两组BCG干预组相互比较无明显差别。至H37Rv攻击后9周，2组BCG组脾指数、肺、肝结核菌负荷均上升，与H37Rv组比较无差别(P>0.05)。肺组织病理显示2组BCG干预组病变范围与H37Rv组比较无差别。 H37Rv感染前，8周龄BCG接种小鼠脾上清IFN-γ高于未接种组。与BCG1组比较，BCG3组IFN-γ水平显著升高，有统计学意义(P<0.05)。感染后3周、6周、9周，H37Rv组、BCG3+H37Rv组和BCG1+H37Rv组IFN-γ水平均显著升高，与saline组比较有统计学差别(P<0.05)。各时间点H37Rv组、BCG3+H37Rv组和BCG1+H37Rv组相互比较无统计学差别(P>0.05)。进一步检测分泌IFN-γ的淋巴细胞频率发现，H37Rv感染的各组分泌IFN-γ的淋巴细胞频率增高，与saline组比较有统计学差别(P<0.05)。仅在6周时，BCG3+H37Rv组与H37Rv组比较，分泌IFN-γ的淋巴细胞频率显著增高(P<0.05)。H37Rv感染后3周，H37Rv组TNF-α水平较saline组明显升高(P<0.05)。两组BCG干预组TNF-α水平被显著抑制(P<0.05)。BCG3+H37Rv组和BCG1+H37Rv组之间无明显差异。至感染后6周和9周，随着结核模型组TNF-α下降，两组BCG组与结核组比较，TNF-α水平无明显显著差别(P>0.01)。IL-2水平不受H37Rv感染影响，各组各时间点相互比较无显著差异(P>0.05)。H37RV感染使IL-12水平升高，但BCG3+H37Rv组和BCG1+H37Rv组与相应时间点H37Rv组比较无明显差异(P>0.05)。 H37Rv感染前，BCG接种对小鼠脾上清IL-4水平无明显影响。H37Rv感染后3周、6周、9周等3个时间点动态监测脾细胞上清IL-4水平发现，感染后3周，经H37Rv攻击的各组小鼠，H37Rv组、BCG3+H37Rv组、BCG1+H37Rv组IL-4水平均显著升高(P<0.05)，与Saline组比较有统计学差别(P<0.05)。与H37Rv组比较，2组BCG干预组IL-4明显降低(P<0.05)，但BCG3+H37Rv组和BCG1+H37Rv组相互比较无显著差别。感染后6周，经H37Rv攻击的各组小鼠IL-4水平继续保持升高，H37Rv组、BCG3+H37Rv组和BCG1+H37Rv组3组之间比较没有差别(P>0.05)。感染后9周，H37Rv组IL-4明显回落。与H37Rv组比较，BCG3+H37Rv组和BCG1+H37Rv组IL-4呈显著升高(P<0.05)。 结论： 新生鼠多次BCG接种预防结核作用仅在感染早期明显优于单次BCG接种。感染后期，新生鼠多次BCG接种和BCG单次接种出现预防作用逐渐下降，病变进展。这一动态变化可能与BCG在感染早期抑制TMF-α水平有关。Th1细胞因子不能作为机体具有结核保护力的指标，Th2细胞因子提示结核病病变处于进展期，并诱导TNF-α对机体的毒性作用。 总结 本研究中我们通过与新生鼠单次接种BCG的对比，首先探讨了新生鼠早期多次接种BCG预防哮喘的作用及可能的参与机制。其次对新生鼠早期多次接种BCG预防结核的效率和Th1、Th2型细胞因子在结核免疫中的作用进行了研究，得出如下结论： 1.新生鼠BCG接种可以诱导机体产生IFN-γ，并维持至成年后，新生鼠多次BCG接种诱导的Th1反应较新生鼠单次BCG接种强。 2.经抗原致敏和激发后，新生鼠多次BCG接种明显抑制成年鼠OVA激发后的AHR、气道Eos炎症及黏液高分泌，而单次BCG接种未能抑制。 3.早期多次BCG接种预防哮喘的机制可能依赖诱导产生的Th1型细胞因子。 4.新生鼠多次BCG接种预防结核作用仅在感染早期明显优于单次BCG接种。感染后期新生鼠多次BCG接种和BCG单次接种一样，预防结核作用逐渐下降，病变进展。 5.BCG接种预防结核的效率出现先强后弱的动态变化，可能与BCG在感染早期抑制TNF-α水平有关。 6.Th1细胞因子不能作为机体具有结核保护力的指标，Th2细胞因子可能提示结核病病变处于进展期，，并诱导TNF-α对机体的毒性作用。

目录

论文说明：缩略语中英文对照

第一部分早期多次接种BCG预防哮喘的研究

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

4结论

参考文献

第二部分早期多次接种BCG预防结核的研究

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

结论

参考文献

卡介苗预防人类疾病的研究进展

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