早期多次卡介苗接种对哮喘小鼠气道重塑的影响及相关免疫机制研究

摘要

支气管哮喘（简称哮喘）是一种以嗜酸性粒细胞（Eosinophils，Eos）、肥大细胞和T淋巴细胞浸润为主的气道慢性炎症性疾病，表现为气道高反应性和可逆性气流受限。气道炎症的反复发生或持续存在会使气道出现不可逆的结构改变，称为气道重塑，其特征主要有：气道周围平滑肌增生/肥大，上皮下纤维化和胶原沉积，上皮细胞黏液化生和黏液高分泌以及微血管的增生。当哮喘发展至气道重塑阶段会出现气流受限的不完全可逆，患者对抗炎治疗的反应下降而使预后交差。
　　 哮喘严重威胁人类健康，其发病率在全世界范围内有增高趋势。目前全球有超过3亿哮喘患者，我国约有3900万哮喘患者。现行的以吸入糖皮质激素为首选的治疗方案能控制哮喘症状，但需长期用药，不能预防及根治其发生，也不能抑制气道重塑的发生。如何从哮喘的发病机制入手寻找一有效的哮喘预防手段是目前面临的难题。
　　 现有研究表明哮喘是一种免疫失衡性疾病，哮喘的发生与机体IFN-γ的微环境缺失和Th2细胞免疫的过度存在相关，大量Th2细胞因子（IL-4，IL-5，IL-13等）的增加，促进了IgE的释放，致使肺组织嗜酸性粒细胞浸润和气道黏液高分泌，导致气道反应性的增高和气道重塑的发生。通过纠正机体失衡的Thl/Th2免疫反应成为预防哮喘研究的热点和靶点。
　　 减毒活菌卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)是一种很强的Thl免疫刺激剂，多项动物研究显示，BCG干预可明显抑制抗原致敏激发所致的气道Eos浸润，降低气道高反应性。流行病学研究关于人体BCG接种与哮喘发生的关系虽然有争议，但是最近一项对23项临床研究的荟萃分析结果表明，人类生命早期接种BCG疫苗能够降低儿童哮喘发生率，进一步支持了BCG接种能够预防哮喘发生的观点。
　　 BCG接种对哮喘的抑制作用与多种因素有关，包括BCG结构重组，采用不同的接种途径、接种次数以及改变接种时间窗等。多年来我们实验室致力于寻求一种最有效的、安全的、有望应用于人类的接种方式。通过一系列的前期研究，我们发现新生儿期幼鼠多次皮下给予小剂量BCG接种可以抑制成年后哮喘的发生，并且该保护作用能维持至老年。既然BCG早期多次接种能长期抑制哮喘气道炎症，那么是否可以进一步抑制与炎症持续存在相关的气道重塑的发生呢？目前为止，有关早期多次BCG接种对哮喘气道重塑的影响尚未见报道。
　　 其次是关于BCG接种抑制哮喘发生的免疫机制问题。虽然多数研究均证实BCG是一很强的Thl免疫刺激剂，但随着调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）和新型Th细胞（Thl7细胞）的发现以及功能的不断研究，BCG是否通过Treg或Thl7来抑制哮喘发生也受到重视。有研究发现IL-17能够促进机体对结核杆菌最佳的Thl免疫反应，介导T细胞分泌IFN-γ，并促进表达IFN-γ的CD4+T细胞向肺内迁移，从而在结核杆菌疫苗干预哮喘的过程中发挥作用。也有研究认为结核杆菌疫苗能够通过诱导Treg增殖抑制哮喘炎症。但以上研究多基于急性炎症模型或体外研究。而现有研究发现，慢性或重症哮喘与急性或轻症哮喘患者中多种炎症因子的表达存在明显差异，如在慢性持续性或重症哮喘患者中Thl7细胞比例和IL-17的表达明显高于轻症患者。基于本研究中我们使用的是慢性气道重塑模型，我们有兴趣观察BCG早期接种在慢性哮喘中的免疫调节模式，而这方面目前鲜见报道。
　　 由此，本实验分两部分进行研究：（1）通过构建小鼠哮喘气道重塑模型，观察新生期多次BCG接种对小鼠哮喘气道重塑发生的影响；（2）通过流式细胞术和real-time PCR检测早期多次BCG接种后肺组织T细胞亚群的变化，从而了解早期多次皮下接种BCG在气道重塑模型中的免疫应答情况。
　　 第一部分：小鼠哮喘气道重塑模型的建立及早期多次卡介苗接种对气道重塑的影响
　　 目的：通过抗原致敏和反复激发建立具有典型气道重塑特征的慢性哮喘模型。观察早期多次卡介苗接种对哮喘气道重塑的影响。
　　 方法：采用BALB/c新生鼠，分为OVA致敏激发组（OVA组）、早期多次BCG接种组（BCG+OVA组）和生理盐水阴性对照组（SHAM组）。BCG+OVA组小鼠分别在出生O、7、14天予以BCG105CFUs的剂量行皮下接种3次，OVA组和SHAM组注射等体积注射用水。小鼠长大至5周时予OVA腹腔注射致敏，2周后第二次致敏，10天后以1％OVA雾化吸入激发，每次40min，每周连续雾化吸入3天，连续8周。最后一次激发后24小时行气道反应性测定。48小时收集标本，行支气管肺泡灌洗液细胞分类计数，肺组织病理切片观察气道炎症、气道周围平滑肌增生、胶原沉积和黏液分泌情况。
　　 结果：OVA组小鼠经抗原致敏和反复激发后出现了典型的气道重塑特征，包括气道周围平滑肌明显增生、胶原沉积增加、气道黏液高分泌以及气道和血管周围大量炎症细胞浸润，同时气道反应性明显增高。而早期多次BCG接种后的小鼠（BCG+OVA组）BALF中炎症细胞总数减少，尤其Eos减少更明显（P﹤0.01）。气道周围平滑肌增生和胶原沉积较OVA组减少，尤其以直径150-250μm的小气道周围减少明显（P﹤0.05）。气道反应性也较OVA组降低（P﹤0.05）。
　　 结论：我们通过OVA抗原致敏和反复雾化吸入激发的方法构建了稳定的具有典型气道重塑特征和气道高反应性的小鼠慢性哮喘模型。新生鼠早期多次BCG接种可降低慢性哮喘模型气道周围炎症细胞尤其是Eos的浸润，减轻气道周围平滑肌增生和胶原沉积，降低气道高反应性，其中对小气道周围气道重塑的抑制较中大气道更为明显。
　　 第二部分：早期多次卡介苗接种减轻哮喘气道重塑的相关免疫机制
　　 目的：观察早期多次BCG接种后肺组织T细胞免疫应答的变化。观察BCG接种对肺组织中Eos活化因子和趋化因子表达的影响，以及对影响气道重建的重要因子TGF-β1表达的影响。
　　 方法：最后一次抗原激发后48小时行肺泡灌洗，ELISA法检测灌洗液上清中IFN-γ、IL-5、IL-17、IL-13、eotaxin-1、TGF-βl的水平。分离肺组织淋巴细胞，经PMA刺激后行表面抗体标记（CD3，CD4，CD8，CD25），细胞破膜处理后标记胞内抗体（IFN-γ，IL-4，IL-17A，IL-10，Foxp3），流式细胞术检测和分析各T细胞亚群的比例。另取肺组织提取RNA，经逆转录后用real-time PCR法检测IFN-γ，IL-17A和Fopx3mRNA的表达。肺组织石蜡切片行TGF-β1免疫组化染色，图像分析计数气道基底膜外围30μmm范围内TGF-β1+细胞数。
　　 结果：与SHAM组相比，OVA组表达IL-4和表达IL-17的T细胞比例增高，而表达IFN-γ的T细胞比例无明显变化。BCG多次接种后肺组织中表达IFN-γ的T细胞明显增高达4倍，尤其表现为Thl细胞的增加（5.01±0.66％ vs0.83±0.18％ ofCD3+T cells，BCG+OVA vs OVA，P﹤0.01）。Thl7细胞、Th2细胞和Treg在OVA组和BCG+OVA组之间无明显差别。real-time PCR检测结果与流式分析的结果一致，BCG接种后仅发现促进FN-γmRNA明显增高，而IL-17A和Fopx3mRNA水平在BCG+OVA组与OVA组之间无明显差异，但这两组的IL-17AmRNA水平均较SHAM组明显增高。用ELISA方法检测BALF中细胞因子表达水平，结果显示：OVA组和SHAM组IFN-γ水平无明显差异，BCG接种组IFN-γ较未接种组明显增高（P﹤0.05）。OVA组BALF中IL-5和Eotaxin-1水平较SHAM组显著增加，BCG+OVA组IL-5和Eotaxin-1水平均下降，两组间相比差异有显著性。IL-13水平OVA组较SHAM组高，BCG+OVA组较OVA组有下降，但统计无显著差异。IL-17水平各组中均很低，在检测的敏感性之外。BALF中TGF-β1水平用ELISA方法检测结果显示：OVA组BALF中TGF-β1水平较SHAM组显著增加，BCG+OVA组TGF-β1水平较OVA组下降，两组间相比差异有显著性。肺组织切片TGF-β1免疫组化染色发现：OVA组气道周围TGF-β1染色阳性的细胞数较SHAM组明显增高，BCG接种组较OVA组降低。
　　 结论：早期多次BCG接种导致肺组织中Thl细胞比例和IFN-γ水平明显升高，而对Treg无明显影响，说明早期BCG皮下接种对慢性哮喘的抑制主要通过诱导Thl免疫而非通过Treg增加而起作用。Thl7细胞和IL-17参与了慢性哮喘炎症和气道重塑发生的过程，但早期皮下接种BCG并不影响其表达。早期多次BCG接种降低了肺组织中IL-5和TGF-β1的水平，可能与气道重塑的减轻相关。

目录

文摘

英文文摘

致谢

缩略语中英文对照

正文

1 第一部分 小鼠哮喘气道重塑模型的建立及早期多次卡介苗接种对气道重塑的影响

1.1 前言

1.2 材料与方法

1.3 结果

1.4 讨论

1.5 小结

参考文献

2. 第二部分 早期多次卡介苗接种减轻哮喘气道重塑的相关免疫机制研究

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 小结

全文总结

参考文献

综述 支气管哮喘气道塑的免疫与炎症机制

附录