拮抗酵母诱导番茄果实抗性基因的分离与功能鉴定

摘要

果实采后真菌性病害造成的经济损失是巨大的。长期以来防治果实的真菌病害一直是使用化学杀菌剂，而化学杀菌剂早就被证实有害于人体健康，因而开发安全无害的果蔬保鲜剂具有重要意义。利用具有拮抗活性的酵母菌种开展生物防治的方法是最有希望替代化学杀菌剂的方法之一。罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)是国内外研究较多的采后拮抗酵母。目前研究认为生防酵母预防采后病原菌的主要作用机制包括：营养与空间竞争、直接与病原微生物作用和诱导寄主抗性三个方面，其中营养与空间竞争被认为是生防酵母主要的作用方式。越来越多的证据表明，生防酵母可以诱导寄主产生抗性，并且这种抗性在采后储存中抵御采后病原微生物的侵染起到了重要的作用。本文以番茄果实为实验材料，主要分为三部分。第一部分，以抑制差减杂交(SSH)和番茄基因芯片方法筛选出罗伦隐球酵母处理后樱桃番茄果实差异表达的基因；从芯片和SSH结果中选出4个差异表达的基因；第二部分，克隆了这四个基因的开放阅读框ORF(Open Reading Frame)并将其转入到拟南芥中以待对其功能进行深入研究。第三部分，用罗伦隐球酵母对番茄进行处理，检测樱桃番茄果实在罗伦隐球酵母和1-MCP单独和结合处理下对番茄果实抗性相关酶活性的影响；其主要研究结果如下：
　　 ⑴以生防菌处理后果实cDNA为‘tester’，以无菌水处理的为‘driver’构建抑制差减杂交(SSH)文库。通过对SSH文库的筛选得到50个差异表达基因，其中33个为已知功能，在已知功能的基因中主要是抗性相关和信号转导相关的基因，而这些基因在其他的胁迫条件下也有上调表达，因此认为正是这些基因的上调表达，增强了番茄果实在生防菌处理后对采后病害的抗性。
　　 ⑵通过番茄基因芯片杂交，我们观察到在生防酵母处理后番茄果实约有4200个基因的表达发生了变化，约占番茄基因总数的12％。通过进一步的筛选芯片杂交结果，我们得到了531个差异表达明显的基因。其中上调表达基因219个，其中96为已知功能，123个功能未知：下调表达基因312个其中个168为已知功能，144个功能未知。在上调表达已知功能的基因中主要包括如下几类：基础代谢22个占已知基因10％；抗性相关基因17个占已知基因7.7％；信号转导10个占已知基因4.5％；；在下调表达已知功能的基因中主要包括如下几类：基础代谢41个占已知基因13％；光合作用24个占已知基因7.7％；能量代谢相关21个占已知基因6.7％。
　　 ⑶通过对基因芯片的结果分析，得到如下的结论：生防菌处理番茄果实后，可以激发SA介导的SAR反应，抑制JA/ET介导的其他抗性反应。而且生长素介导的抗性反应也可能在生防酵母处理下起到一定的作用。同时生防酵母处理后可以明显的抑制番茄果实中光合作用和能量代谢相关基因的表达。
　　 ⑷为进一步研究相关基因的功能，我们克隆得到了4个基因的ORF并构建了过表达载体，并将其转导拟南芥中，通过除草剂筛选，目前已经得到拟南芥转基因苗。
　　 ⑸以绿熟期樱桃番茄果实为试验材料，用1μl/L浓度1-甲基环丙烯(1-MCP)进行处理24小时，在室温条件下自然贮藏，研究1-MCP处理对番茄果实抗性相关酶：过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)、脂肪氧合酶(LOX)活性和丙二醛(MDA)含量的影响。结果表明：1-MCP处理可以抑制LOX和PAL的活性；刺激CAT活性峰值提前；提高MDA含量；刺激PPO和POD活性上升，但是1-MCP处理对SOD活性影响不大。1-MCP和罗伦隐球酵母结合处理可以刺激组织中POD活性上升和MDA含量增加，抑制组织中SOD活性。而对其他酶的活性没有显著影响。

目录

文摘

英文文摘

基金项目

致谢

简写对照表

第一章 文献综述

1.1 植物抗性基础

1.1.1 植物对病原菌的识别

1.1.2 植物防卫反应信号传导

1.2 果实抗性特征

1.2.1 果实的结构性抗性

1.2.2 果实中可诱导物质的抗病性成分

1.3 生防菌作用机理研究综述

1.3.1 分泌抗生素

1.3.2 营养竞争和空间竞争

1.3.3 分泌胞外水解酶

1.3.4 诱导影响果实组织的抗病性

1.4 研究的目的意义

第二章 应用抑制差减杂交的方法筛选差异表达基因

2.1 引言

2.2 材料和方法

2.2.1 番茄果实和罗伦隐球酵母

2.2.2 番茄果实处理

2.2.3 番茄果实总RNA的提取

2.2.4 mRNA的提取

2.2.5 第一链合成

2.2.6 第二链合成(切口平移法)

2.2.7 SSH文库构建

2.2.8 SSH文库的转化

2.2.9 SSH文库的初步筛选

2.2.10 反向Northern杂交

2.2.11 RT-PCR分析

2.3 试验结果

2.3.1 总RNA提取结果

2.3.2 Rsal酶切结果

2.3.3 接头连接结果分析

2.3.4 两轮PCR结果分析

2.3.5 SSH文库效率分析

2.3.6 文库PCR筛选

2.3.7 Northern blot结果

2.3.8 序列信息分析

2.3.9 RT-PCR结果分析

2.4 讨论

第三章 应用番茄基因芯片分离差异表达基因

3.1 引言

3.2 材料和方法

3.2.1 番茄果实和罗伦隐球酵母

3.2.2 番茄果实处理

3.2.3 总RNA提取

3.2.4 mRNA提取

3.2.5 RNA标记和芯片杂交

3.2.6 数据分析

3.2.7 RT-PCR分析

3.3结果与分析

3.3.1 总RNA质量分析

3.3.2 芯片杂交结果分析

3.3.3 RT-PCR结果

3.4 讨论

第四章 抗性相关基因的克隆和过表达转基因拟南芥的构建

4.1 引言

4.2 材料和方法

4.2.1 相关基因开放阅读框(Open reading frame ORF)克隆

4.2.2 用TOPO和LR反应克隆ORF到pB2GW7质粒中

4.2.3 构建转基因拟南芥

4.3 结果与分析

4.3.1 总RNA提取结果

4.3.2 ORF克隆结果

4.3.3 TOPO反应结果检验

4.3.4 LR反应结果检验

4.3.5 农杆菌电击转化结果检验

4.3.6 Bar基因筛选结果

4.4 讨论

第五章 罗伦隐球酵母和1-MCP单独和结合处理对番茄果实抗性相关酶活性的影响

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.2 番茄果实处理

5.2.3 酶提取和测定的程序

5.2.4 统计分析

5.3 结果与分析

5.3.11-MCP对整果抗性相关酶活性的影响

5.3.2 罗伦隐球酵母和1-MCP结合或单独处理对番茄果实抗性相关酶活性的影响

5.3.3 本章试验结果小结

5.4 讨论

第六章 结论与展望

6.1 本论文的主要研究成果

6.2 本论文的主要创新点

6.3 本论文的不足之处及后续工作设想

6.3.1 本论文不足之处

6.3.2 后续工作设想

攻读博士学位期间发表的论文

参考文献