家蚕烟碱型乙酰胆碱受体与电压门控钠通道基因研究

摘要

昆虫烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)和电压门控钠离子通道(Voltage-gated sodium channel，VGSC)是昆虫神经传导过程中的重要蛋白，分别为新烟碱类和拟除虫菊酯类杀虫剂的作用靶标。鳞翅目是昆虫纲第二大目，其幼虫通常为植食性，其中有许多农业害虫。家蚕为鳞翅目模式生物，研究家蚕nAChR和电压门控钠通道对害虫防治具有重要意义。 nAChR基因家族通常含有十个以上的成员，这些成员的组合形成了nAChR复杂的分子类型，对生理功能的研究造成了很大困难。迄今为止，昆虫nAChR未能通过自己亚基组合在爪蟾卵母细胞内表达，用于电生理学性质的研究和农药筛选。本文对家蚕nAChR进行了以下研究： 通过Blast检索家蚕基因组数据库和RT-PCR、RACE技术，克隆了家蚕12个编码nAChR亚基基因的全长ORF。家蚕nAChR基因与果蝇nAChR基因相似性最高达86％；其中9个亚基亚基为α型，3个亚基为β型；果蝇、冈比亚按蚊、蜜蜂和家蚕的α6亚基具有相同的内含子位置。 亚基α4含有一对相互排斥的外显子3，亚基α8含有一对相互排斥的外显子7。亚基α8相互排斥的外显子编码TM2和TM3，迄今为止仅在家蚕中发现。α4截短的转录本缺少外显子6～8，这些外显子编码LoopF和TM1-3。α5截短的转录本缺少外显子4，导致下游阅读框发生移码和翻译提前终止，只剩下一个很小的开放阅读框，只有α6亚基上发现了五个RNA编辑位点，5个碱基的RNA编辑(nts＃392，394，395，447，454)导致了四个氨基酸的变异(N131S,N132G,I149M,T152A)。 使用real-timePCR技术，对七个转录本在不同发育阶段，幼虫不同体段进行了表达量分析。结果表明：所有转录本在头部表达量最高，腹部表达量最低；所有转录本在蛹和成虫阶段的表达量都高于幼虫。在胚胎期，转录本α4exon3、α7、β1的表达量高于幼虫，而转录本α2、α8exon7a、α8exon7b的表达量低于幼虫，转录α4exon3表达量和幼虫相当。在昆虫细胞中高效表达了所有亚基的胞外受体片段，为受体相互作用研究打下了基础。 通过家蚕基因组数据库检索结果和RT-PCR技术，克隆了家蚕钠通道基因的全长ORF，命名为BmNav。BmNavORF全长6,258bp，编码2,085个氨基酸残基，含有34个外显子。BmNav和果蝇、德国小蠊、人钠通道氨基酸序列相似性分别为74％、77％、43％。家蚕钠通道含有24个跨膜螺旋，分属于钠通道的4个结构域，每个结构域含有6个跨膜螺旋。 对胚胎、幼虫、蛹、成虫四个发育时期的BmNavPCR产物进行超通量Solexa测序。测序结果未发现RNA编辑，发现BmNav存在大量可变剪接.外显子丢失除发生于结构域之间的连接肽之外，还发生于膜结构，可选择性外显子2、外显子12和外显子22i编码结构域之间的连接肽，它们的丢失不影响通道的保守结构，不含外显子2的转录本在四个发育时期的含量达到33％～55％，外显子12为家蚕特有。家蚕BmNav存在两对相互排斥的外显子，19a/b和27a/b。Solexa测序发现不含外显子19的转录本在幼虫阶段表达量异常高，常规RT-PCR验证发现，这种高量表达在五龄幼虫第三天达到峰值，随后下降。

目录

文摘

英文文摘

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致谢

前言

第Ⅰ部分文献综述

第1章烟碱型乙酰胆碱受体研究

1.1烟碱型乙酰胆碱受体的生理功能

1.2脊椎动物烟碱型乙酰胆碱受体的组成

1.3烟碱型乙酰胆碱受体的结构

1.4昆虫烟碱型乙酰胆碱受体的组成

1.5烟碱型乙酰胆碱受体与杀虫剂

1.6烟碱型乙酰胆碱受体的电生理学研究

1.7昆虫烟碱型乙酰胆碱受体的亚基组成

1.8烟碱型乙酰胆碱受体与农药的抗性

第2章电压门控钠离子通道研究

2.1电压门控钠离子通道的结构与功能

2.2电压门控钠离子通道与神经毒素

2.3昆虫电压门控钠离子通道

2.4电压门控钠离子通道与杀虫剂

2.5电压门控钠离子通道与昆虫的杀虫剂抗性

2.6电压门控钠离子通道基因的可变剪接

2.7电压门控钠离子通道基因的RNA编辑

第Ⅱ部分实验内容

第3章家蚕烟碱型乙酰胆碱受体基因家族的克隆

3.1材料与方法

3.2实验结果

3.3讨论

3.4小结

第4章家蚕烟碱型乙酰胆碱受体基因分析

4.1实验方法

4.2实验结果

4.3讨论

4.4小结

第5章家蚕烟碱型乙酰胆碱受体亚基基因表达量测定

5.1材料与方法

5.2实验结果

5.3讨论

5.4小结

第6章家蚕烟碱型乙酰胆碱受体基因在昆虫细胞中表达

6.1材料与方法

6.2实验结果

6.3讨论

6.4小结

第7章家蚕电压门控钠离子通道基因的克隆

7.1材料与方法

7.2实验结果

7.3讨论

7.4小结

第8章家蚕电压门控钠离子通道基因的可变剪接

8.1材料与方法

8.2实验结果：

8.3讨论

8.4小结

研究总结

参考文献

作者简历

在读博士期间发表的论文

学术会议论文摘要