双生病毒卫星DNA与脉突和耳突症状相关的遗传决定因子研究

摘要

双生病毒/DNAβ病害复合体在自然寄主上能诱导不同的症状表型。烟草曲茎病毒(Tobaccocurlyshootvirus，TbCSV)/DNAβ在烟草和番茄上能引起曲叶症状，而中国番茄黄化曲叶病毒(TomatoyellowleafcurlChinavirus，TYLCCNV)/DNAβ除引起曲叶外还引起寄主的脉突和耳突症状。为了确定症状差异的遗传决定因子，对TbCSV/DNAβ和TYLCCNV/DNAβ进行了假重组试验，结果表明脉突和耳突的表型是由TYLCCNVDNAβ决定的。DNAβ互补链上编码一个保守的ORF，即βCl，对TYLCCNVDNAβ的βCl的突变发现它编码一个症状决定因子，表达TYLCCNVDNAβ的βCl的转基因烟草产生曲叶、畸形和叶背面组织增生等发育异常的表型，而大部分转化TbCSVDNAβ的βCl基因的烟草和番茄植株均与正常植株类似，只有少数烟草表现出轻微叶上卷表型。为了进一步定位DNAβ上决定症状的遗传决定因子，利用OverlapExtensionPCR的方法对两个卫星的βClORF及其上游约430nt的片段(包含A-rich区和βCl基因转录起始位点上游173nt或200nt的片段，简称为片段AP)分别进行了互换。构建嵌合体卫星的侵染性克隆，分别与辅助病毒TbCSV和TYLCCNV共同接种烟草和番茄。嵌合有TbCSVDNAββCl的TYLCCNVDNAβ丧失了诱导脉增厚和耳突表型的能力；嵌合有TYLCCNVDNAββCl或AP片段的TbCSVDNAβ也不能诱导植株产生典型的脉增厚和耳突。而嵌合TbCSVAP片段的TYLCCNVDNAβ则产生了耳突，但是耳突的数量减少、大小变小，并延迟产生。通过组织化学法和荧光光度法测定启动子的活性，发现TbCSVDNABββCl基因上游的全长片段拥有启动子活性，它能驱动GUS在转基因烟草中组成型表达。Southern印迹分析说明了所有嵌合体卫星均能系统侵染寄主植物，而且无论是辅助病毒还是卫星分子，其在植物体内的积累量与病害复合体引起的表型差异无关。上述结果表明，DNAβ编码的βCl蛋白对病害复合体TbCSV/DNAβ和TYLCCNV/DNAβ产生的症状差异起主导作用，但βCl的启动子也能影响症状诱导。 对接种含TYLCCNVDNAββCl的PVX(PVX-Y10βCl)和PVX空载体的本氏烟植株分别提取RNA，进行miRNA芯片分析，结果表明，与杨树miR398b、番茄miR397、拟南芥miR397a以及拟南芥miR166a序列同源的miRNA积累量在两个样品之间存在显著性差异。Northern印迹结果验证了miR165/166同源物的积累量在表达TYLCCNVDNAββCl的本氏烟中特异性降低。这表明βCl有可能通过某种机制降低miRNA的量，减弱miRNA的有效切割，从而打乱植物的正常发育。

目录

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论文说明：缩略语表

声明

致谢

1绪论

1.1双生病毒科的分类、寄主范围及传播介体

1.2双生病毒的基因组结构和功能

1.3双生病毒的侵染过程

1.3.1双生病毒的复制和转录

1.3.2双生病毒的运动

1.4双生病毒的致病相关因子

1.4.1 C4

1.4.2 C2/AC2

1.4.3 BC1

1.4.4 BV1

1.4.5 βC1

1.5植物miRNA的研究进展

1.5.1植物microRNA家族及其靶标的进化

1.5.2植物中保守miRNA的系统发生分布

1.5.3 microRNA的生物合成

1.5.4植物miRNA的作用模式

1.5.5植物microRNA的靶标识别

1.5.6植物microRNA介导的调控范围

1.5.7 miRNA在植物和病毒在对抗机制竞争中的作用

1.5.8 miRNA在植物抗病毒防御中的应用

1.5.9 RNA沉默抑制子影响miRNA代谢

2 TbCSV与TYLCCNV病害复合体症状差异的遗传决定因子定位

2.1材料与方法

2.1.1病毒和植物材料

2.1.2菌株和载体

2.1.3 TbCSV-Y35 DNAβ与TYLCCNV-Y10 DNAβ 4个嵌合体卫星构建

2.1.4嵌合体分子的侵染性克隆构建

2.1.5三亲交配及农杆菌接种

2.1.6植物总DNA提取(CTAB法)

2.1.7地高辛法Southern印迹检测

2.1.8烟草的转化

2.1.9番茄的转化

2.1.10植物总RNA提取

2.1.11 northern印迹分析

2.2结果与分析

2.2.1 TbCSV-Y35与TYLCCNV-Y10假重组实验

2.2.2表达Y35βC1转基因植株的症状

2.2.3嵌合体卫星诱导的症状类型分析

2.2.4病毒DNA积累水平分析

2.3讨论

3烟草曲茎病毒卫星启动子的鉴定

3.1材料与方法

3.1.1植物总DNA的制备

3.1.2载体构建

3.1.3瞬间表达

3.1.4转基因烟草的PCR鉴定

3.1.5 Northern blot分析

3.1.6 GUS活性的组织化学染色

3.1.7 GUS荧光活性分析

3.2结果与分析

3.2.1 βC1 ORF启动子表达载体的构建

3.2.2瞬间表达中GUS活性的组织化学检测

3.2.3瞬间表达中GUS荧光活性分析

3.2.4转基因烟草的获得和分子鉴定

3.2.5转基因普通烟中GUS活性的组织化学分析

3.2.6转基因普通烟中的GUS荧光活性分析和Northern blot分析

3.3讨论

4 TYLCCNV卫星DNA的βC1基因对植物miRNA积累影响的初步研究

4.1材料与方法

4.1.1植物材料

4.1.2 SDS-PAGE电泳和Western印迹分析

4.1.3 miRNA芯片实验基本流程

4.1.4小RNA获得和Northern印迹分析

4.2结果与分析

4.2.1 Western印迹分析植株中βC1蛋白的表达

4.2.2 Microarray分析miRNA的差异表达

4.2.3 northern印迹验证特异的miRNA差异表达

4.3讨论

5全文小结

参考文献

附录