乳酸链球菌素治疗奶牛临床型乳房炎的研究

摘要

尽管国内外学者对奶牛乳房炎进行了大量研究,但该病仍然是引起奶牛养殖业经济损失最为严重的疾病之一。目前,治疗奶牛乳房炎的常用方法是乳房内灌注抗生素。随着抗生素大量、广泛应用,乳房炎致病菌的耐药性越来越严重,临床治疗效果越来越不理想。用抗菌药物治疗奶牛乳房炎容易造成药物在牛奶中的残留,影响乳品质量,给奶牛养殖业和乳品加工业造成巨大的经济损失；同时,残留在牛奶及乳制品中的抗生素还对人类健康造成威胁。因此,研制无有害残留的非抗生素制剂成为奶牛乳房炎研究方面的一个热点。此外,除了细菌的耐药性之外,很少有学者从细菌和药物在乳房内的分布探讨影响药物疗效的因素。本论文首先对乳房炎主要致病菌和常用抗菌药物在牛奶中的分布进行研究,探讨影响抗菌药物疗效的因素；然后系统研究了Nisin Z对奶牛临床型乳房炎自然发病病例的治疗效果。
　　 1.乳房炎主要致病菌在牛奶中的分布研究
　　 为观察乳房炎主要致病菌在牛奶中的分布情况,首先对一次挤奶过程不同时段挤出牛奶的主要乳成份进行了分析。选取健康泌乳盛期荷斯坦奶牛4头,于挤奶前期、挤奶中期和挤奶末期无菌操作采集乳区牛奶进行乳成份分析。结果表明,随着挤奶过程的进行,乳脂肪含量显著升高(P＜0.05),挤奶末期最高；乳蛋白、非脂乳固体和乳糖含量先升后降,挤奶末期最低,与挤奶前期和中期相比差异显著(P＜0.05)。牛奶中添加一定量的乳房炎致病菌金黄色葡萄球菌或大肠杆菌,4℃静置8、12、24h后分割成上、中、下三等份,采用平板菌落计数法测定各部分牛奶中的细菌数。结果发现,两种致病菌在牛奶中的菌落数从下部到上部呈现上升趋势,且上部牛奶中的菌落数显著高于中、下部(P＜0.001),而中、下部之间差异不显著(P＞0.05)。从本研究结果推测,乳房炎致病菌经乳头管侵入后可以随牛奶中的脂肪滴上浮,侵入乳腺的深层组织。
　　 2.常用抗菌药物在牛奶中的分布研究
　　 在牛奶中添加一定浓度的常用抗菌药物,4℃静置8、12、24 h后分割成上、中、下三等份,采用琼脂扩散法对不同部位牛奶中抗菌药物对指示菌的抑菌作用进行分析比较。结果显示:大部分抗菌药物在牛奶中的抑菌作用从牛奶上部到下部逐渐增强,其中青霉素、庆大霉素、盐酸林可霉素和氨苄西林钠4种极性较强的抗生素三部分之间变化明显；抗菌多肽Nisin Z在牛奶中呈现较好的分布趋势,上、中、下三部分牛奶中Nisin Z的抑菌作用基本一致,且上部牛奶的抑菌作用略高于中、下部,提示Nisin Z可分布于乳腺的深部组织,适于制成乳房内灌注制剂。
　　 3.Nisin Z对金黄色葡萄球菌的体外药敏试验
　　 从临床型乳房炎病乳中分离到的37株金黄色葡萄球菌,仅有6株(16.2％)对青霉素G敏感,22株(59.5％)完全耐药；6株(16.2％)对庆大霉素耐药；而所有菌株均对Nisin Z敏感。
　　 4.Nisin乳房灌注剂对奶牛临床型乳房炎的治疗效果观察
　　 92头临床型乳房炎自然发病病例(107个患病乳区)随机分为试验组(48头,51个乳区)和对照组(44头,56个乳区),试验组乳房内灌注含Nisin Z2,500,000 IU的Nisin乳房灌注剂,对照组乳房内灌注含量为0.8 g的庆大霉素注射液,用量均为2次/d。通过测定治疗前和停药后第1、2周患病乳区细菌学变化、体细胞数以及酸奶发酵情况,确定Nisin乳房灌注剂对奶牛临床型乳房炎的治疗效果。试验结果表明,两组的临床治愈率基本一致(90.2％和91.1％),但Nisin乳房灌注剂治疗组的微生物治愈率高于庆大霉素治疗组,分别为60.8％和44.6％,统计学比较差异不显著(P＞0.05)。Nisin乳房灌注剂治愈后第1、2周,分别有50.0％和47.8％的患病乳区SCC恢复到500,000个/mL以下,略高于庆大霉素治疗组的33.3％和37.3％。患病乳区的细菌学分析发现,主要致病菌为无乳链球菌和金黄色葡萄球菌,分别占总发病乳区的37.4％和15.9％；其次是凝固酶阴性葡萄球菌(CNS),占总发病乳区的9.3％。Nisin乳房灌注剂治疗后第2周,金黄色葡萄球菌感染乳区转阴率为54.5％(6对11),而庆大霉素治疗组仅为33.3％(2对6)；无乳链球菌感染乳区,两组转阴率分别为83.3％(15对18)和50.0％(11对22)。Nisin乳房灌注剂治疗病例,在停药后12 h用药乳区牛奶中Nisin Z效价仅为4.5 IU/mL,远低于国家标准规定的乳制品中Nisin的最大添加量(0.5 g/kg,约合500 IU/mL)；用药乳区牛奶酸奶发酵过程受到轻度抑制,并持续到停药后36 h,非用药乳区混合牛奶在整个采样时间内发酵正常。庆大霉素治疗病例,用药乳区牛奶在停药后60 h内发酵过程受到严重抑制,停药后72 h发酵恢复正常,非用药乳区混合牛奶在停药后60 h内酸奶发酵过程也受到不同程度的抑制。上述结果表明,Nisin乳房灌注剂对奶牛临床型乳房炎具有较好的治疗效果,仅在短时间内影响酸奶的发酵。
　　 5.ECLIPSE50对Nisin乳房灌注剂治疗后牛奶中Nisin Z残留检测
　　 ECLIPSE50是一种广泛用于检测牛奶中抗生素和抑制剂的试剂盒。为探讨ECLIPSE50对牛奶中Nisin Z残留检测的可行性,在无抗奶中添加Nisin标准品,测定ECLIPSE50对牛奶中Nisin的检测极限,并对Nisin乳房灌注剂治疗乳房炎病例牛奶中的Nisin Z残留进行了分析。试验结果表明:ECLIPSE50对牛奶中Nisin的检测极限为5×10-4～5×10-3mg/mL,折合成Nisin效价为0.5～5IU/mL,即牛奶中允许Nisin的最大残留量为5 IU/mL。Nisin乳房灌注剂治疗后8 h,灌注乳区牛奶ECLIPSE50检测阳性,无抗奶稀释5,000倍后检测阴性；非用药乳区混合牛奶ECLIPSE50阴性。本研究结果提示,ECLIPSE50可用于牛奶中Nisin残留的检测。
　　 6.Nisin乳房灌注剂治疗临床型乳房炎后对奶牛泌乳性能的影响
　　 选取临床型乳房炎自然发病病例9头,乳房内灌注Nisin乳房灌注剂进行治疗,通过检测日产奶量以及停药后2、7、14、21 d的主要乳成份指标,确定Nisin乳房灌注剂对临床型乳房炎病例泌乳性能的影响情况。结果显示,患病乳区乳腺组织得到一定程度的修复,日产奶量逐渐恢复,停药后第8 d的日产奶量与发病前第6 d相比,平均降幅2.5 kg。治愈后患病乳区牛奶乳脂肪、乳蛋白、乳糖和非脂乳固体含量都呈现上升趋势,但与同期相比,略低于非用药乳区混合牛奶；其中,乳糖含量增加幅度较快,除停药后第2 d的治疗乳区外,乳糖含量均在4.7％以上,提示奶牛乳房炎病例经Nisin乳房灌注剂治疗后,受损乳腺组织修复较快,乳腺上皮细胞合成乳成份的能力大幅度提高。
　　 综上所述,乳房炎主要致病菌和常用抗菌药物在牛奶中分别向上下两极移动,这种分布上的分离现象导致抗菌药物和致病菌不能充分接触可能是导致临床上乳房炎治疗失败的一个重要因为；而Nisin Z在牛奶中具有较好的分布趋势,可研制成乳房内灌注制剂用于治疗奶牛乳房炎。Nisin Z体外可有效抑制奶牛乳房炎主要致病菌金黄色葡萄球菌的生长繁殖,即使对常规抗生素耐药菌株也有较好的抑菌效果。用Nisin乳房灌注剂治疗奶牛临床型乳房炎,微生物治愈率为60.8％,略高于常规抗生素治疗组(44.6％)。Nisin乳房灌注剂治愈病例感染乳区体细胞数明显下降,牛奶中乳脂肪、蛋白质、乳糖和非脂乳固体含量呈现上升趋势,停药36 h后乳区牛奶酸奶发酵正常。