肠杆菌科细菌质粒介导喹诺酮耐药机制研究

摘要

喹诺酮类药物作为广谱抗菌药在临床上应用十分广泛，由此带来的耐药问题也日益严重。以往的观点认为喹诺酮耐药主要由于细菌染色体上药物靶蛋白的突变造成，但近年来发现了质粒介导的喹诺酮耐药机制，包括qnr基因、氨基糖苷乙酰转移酶变体aac(6')-Ib-cr和外排泵基因qepA，这些机制虽然只能引起低水平的喹诺酮耐药，却有利于细菌筛选出染色体突变的高水平耐药株。这些基因可以通过质粒接合、转座等途径和其它常位于质粒上的耐药基因特别是β内酰胺酶基因一起快速传播，已经给临床用药带来了巨大威胁。
　　 我们首先调查了临床收集共362株产超广谱β内酰胺酶的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中质粒介导喹诺酮耐药基因qnr，aac(6')-Ib-cr和qepA的流行情况.筛查主要采用PCR扩增的方法，对于耐药基因阳性的菌株，使用Etest条测量了它们的最小抑菌浓度，用脉冲场凝胶电泳的方法调查了这些菌株间相互的同源关系，接合实验和Southem杂交实验用以证明这些耐药基因为质粒编码。在总共362株肠杆菌科临床菌中，共筛选出携带qnr基因菌株29株(占8.0％)，其中qnr的亚型基因qnrA为13株(占3.6％)，qnrB为8株(占2.2％)，qnrS为9株(占2.5％)，有一株菌株同时携带qnrB、qnrS两个基因.同时还筛选出氨基糖苷类耐药基因aac(6')-Ib共62株(占17.1％)，可以同时介导喹诺酮药物耐药的变体基因aac(6')-Ib-cr占其中的36株(占总菌株数9.9％)。所有菌株未发现携带有qepA基因。qnr基因、aac(6')-Ib-cr基因和编码超广谱β内酰胺酶的基因通常都位于同一质粒上，并通过接合、转座作用转移和传播。
　　 因此我们挑选了一株携带qnrA基因的肺炎克雷伯菌进行了质粒基因环境的深入研究。该菌株携带的多重耐药性质粒pKP96被完整测序并利用生物信息学方法分析了其编码基因的环境和结构.质粒DNA全序列测定采用的是鸟枪法随机打碎构建文库的方法，临床菌株和接合菌株的最小抑菌浓度也是通过Etest条方法测定.经过序列的拼接和分析发现质粒pKP96全长为67850bp，属于IncN质粒不相容性分组。质粒全序列上共分析定位了70个基因，其中包括9个和抗菌药物耐药相关的基因。质粒pKP96的接合转移基因区域以及复制相关区域和之前报道的一个简单质粒R46的全序列有非常高的同源性，相似度达到了91％，而和质粒R46相比多出的区域，即为携带了多个耐药基因的多重转座区域以及整合子区域，其中包括喹诺酮耐药基因qnrA1、aac(6')-Ib-cr和超广谱β内酰胺酶基因blacrX-M-24。多重耐药性质粒可以看作是一个经过多次转座、整合进化而成的复杂嵌合体，在进化选择压力下整合了众多耐药基因而被自然筛选出来。

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第1章 综述 质粒介导喹诺酮耐药的广泛流行

1.1喹诺酮类药物的作用机制及常见的耐药机制

1.1.1喹诺酮类药物

1.1.2喹诺酮类药物的作用机制

1.1.3喹诺酮类药物常见的耐药机制

1.2质粒编码喹诺酮耐药基因的发现

1.2.1质粒编码QnrA蛋白的发现

1.2.2 Qnr家族其它蛋白

1.2.3 AAC(6’)-Ib-cr

1.2.QepA

1.3质粒介导喹诺酮耐药基因的耐药机制及耐药活性

1.3.1 Qnr蛋白家族的耐药机制

1.3.2 Qnr的耐药活性

1.3.3.AAC(6’)-Ib-or的耐药机制及耐药活性

1.3.4 QepA的耐药机制和耐药活性

1.4质粒介导喹诺酮耐药基因的流行

1.4.1 Qnr的流行与传播

1.4.2其它质粒介导耐药基因的流行与传播

1.5 qnr基因的遗传环境

1.6 qnr基因的起源和进化

1.7质粒介导喹诺酮耐药在临床上的重要性

第2章产ESBLs大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌质粒介导喹诺酮耐药基因研究

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1材料

2.2.2方法

2.3结果与讨论

2.3.1 结果

2.3.2讨论

第3章多重耐药性质粒DNA全序列分析

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1材料

3.2.2方法

3.3结果与讨论

3.3.1 结果

3.3.2讨论

参考文献

攻读博士学位期间主要的研究成果