重组人肝再生增强因子的克隆和在毕赤酵母中初步表达

摘要

肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration，ALR)有促进肝细胞再生、抗肝纤维化等作用，对各种原因的肝衰竭、重型肝炎等情况下的肝细胞再生有重要作用。本研究已经实现了人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration，h—ALR)在大肠杆菌中的表达，但表达产物是以无活性的单体形式(15KD)存在。由于真核表达系统—毕赤酵母表达系统对所表达蛋白有磷酸化、糖基化、二硫键形成等蛋白加工功能，且迄今已有多种蛋白实现了在毕赤酵母中的活性表达。所以我们拟实现人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达，以期得到有活性的蛋白。 本研究分两部分进行研究。 第一部分，在大肠杆菌DH5α中实现人肝再生增强因子重组克隆的构建。以本实验室保存菌株为模板，利用PCR扩增方法，克隆得到预期大小基因，约为424bp。之后通过BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切作用，将同样经过BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切作用的载体pPIC3.5K连接，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，抽提阳性大肠杆菌DH5α的质粒行BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切和PCR初步鉴定后，将阳性重组载体送检测序，最后成功构建重组载体pPIC3.5K—ALR。 第二部分，将重组表达载体pPIC3.5K—ALR用SalⅠ酶切使其线性化后，电转化感受态宿主菌GS115，通过MM和MD平板筛选得到Mut+转化子，并通过PCR检测筛选得到阳性重组毕赤酵母菌株。转化后阳性菌株经BMMY诱导后，分别在诱导0时、12时、24时、48时、96时取样。分别对不同诱导时间样品的上清和细胞沉淀行SDS-PAGE检测，结果在细胞沉淀中得到了预期约40KD大小的蛋白，从而初步实现了ALR在毕赤酵母中的表达。

目录

文摘

英文文摘

声明

致谢

第一部分重组人肝再生增强因子克隆表达载体的构建

1引言

2实验材料与仪器

3实验方法

4实验结果

5讨论

第二部分 重组人肝再生增强因子重组载体在毕赤酵母中初步表达

1引言

2实验材料与仪器

3实验方法

4表达蛋白初步分析——SDS-PAGE

5 实验结果

6讨论

7下一步的研究方向

参考文献

附录硕士期间发表的文章和参与的研究