三个新的人内源性逆转录病毒(HERV)相关基因的研究

摘要

人内源性逆转录病毒(humanendogenousretrovirus，HERV)是几百万年前整合到人类基因组中的逆转录病毒的残余物，即现在人类基因组上与逆转录病毒同源的DNA序列。虽然长期的进化过程使得它们失去了病毒蛋白的编码能力，越来越多的研究证实它们的异常表达与肿瘤等很多疾病相关。利用基因芯片技术寻找结肠癌相关基因时发现了一个586-bp序列在结肠癌标本中特异高表达，分析结果显示该586-bp为HERV相关序列。Blast发现“假基因”psiTPTE22编码的含HERV序列的mRNA与该586-bp同源性最高。 本研究对psiTPTE22在结肠癌中的表达检测发现其与结肠癌不相关，但在此基础上找到了两个与结肠癌相关的新基因：HERV-HX和HERV-H4p15.2。对psiTPTE22进一步的研究发现了一个与肾癌等有关的功能新基因psiTPTE22-HERV。三个新基因均含有HERV序列。本研究的内容包括了对这三个HERV相关基因的鉴定、在肿瘤中的表达及调控和功能初探等。 结肠癌相关新基因HERV-HX:RT-PCR检测发现psiTPTE22的表达水平在结肠癌与癌旁正常标本之间没有差异，因此不是586-bp芯片序列检测到的结肠癌相关基因。但靶向psiTPTE22的HERV相关序列的引物能扩增出一些结肠癌标本特有的PCR产物(非靶基因产物)。对这些结肠癌相关PCR产物的研究鉴定出了一个新的定位于X染色体上的H家族HERV(HERV-H)基因，定义为HERV-HX。通过RACE等实验获得了全长的转录产物序列并提交到GenBank序列库(EF194101)。原位杂交和定量RT-PCR实验证实该基因在结肠癌组织中特异高表达。序列分析发现HERV-HX的前病毒序列存在大片段缺失，其env区缺失的序列正好相应于env基因的ORF。采用RT-PCR方法对HERV-HX与含完整env-ORF的HERV-H元件的表达进行了比较，发现HERV-H元件在结肠癌中的表达与env基因没有相关性。启动子活性实验证实HERV-HX的5’长末端重复序列(longterminalrepeat，LTR)的U3区中的一段17-bp序列对其表达非常重要。RNA干扰实验knock-downHERV-HX能抑制肠癌HT29细胞的增殖，并增加凋亡。结肠癌相关新基因HERV-HX可能在结肠癌的发生发展中有重要功能。 功能新基因psiTPTE22-HERV:psiTPTE22基因虽被定义为一个假基因，但我们的序列分析发现其上游序列与“真基因”没有同源性，而是包含一个HERV-H元件的人类特有基因(定义为psiTPTE22-HERV)，定位于染色体22q11.2。通过RT-PCR和RACE等实验获得了psiTPTE22-HERV的三个转录产物的全长序列并提交到GenBank序列库(EU541207、EU541208和EU541209)。RT-PCR和定量RT-PCR检测发现该基因在肾、肝、胃和肺的癌旁正常组织中高表达，而在相应的癌组织中低表达。亚硫酸盐测序PCR的结果显示该基因在癌细胞中被DNA甲基化沉默。DNA甲基化抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂的处理能诱导该基因在多种肿瘤细胞中表达。蛋白检测结果显示该基因能翻译出蛋白产物并主要定位于胞浆。Knock-down该基因能显著抑制人胚肾293T细胞的增殖，引起G1期阻滞并增加凋亡，提示该基因的表达对细胞的生长具有重要的生理功能，它的表达沉默不是肿瘤发生的最初诱因。Knock-down或过表达该基因后用低浓度5-氟脲嘧啶处理293T细胞，结果显示该基因的表达水平与细胞对药物的敏感性正相关。psiTPTE22-HERV是一个与多种癌症负相关的功能复杂的新基因。 与结肠癌等负相关的新基因HERV-H4p15.2：在利用RT-PCR和3’RACE实验研究psiTPTE22-HERV时偶然克隆到了两段新序列(GenBank:EF535612、EF535613)。序列分析结果显示它们来自同一个新基因，因此对其进一步进行了5’RACE实验，全长1.3-kb的转录产物已提交到GenBank序列库(EU669866)。该基因位于染色体4p15.2上，DNA序列包括一个结构不完整的5.0-kbHERV-H元件及其上游的一个Alu元件。由4个外显子组成的全长RNA序列没有预测到ORF，可能是一个mRNA样非编码RNA分子。RT-PCR和定量RT-PCR结果显示该HERV-H相关RNA的表达在结肠、胃和肾的癌标本中低，而在相应癌旁正常标本中高。DNA甲基化抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂的处理能诱导其在肠癌细胞中表达，提示该基因可能由表观遗传学变化调控。 这三个HERV相关基因各具特点，它们的发现对HERV相关基因的研究和完善对人类基因组的认识都有重要意义。进一步阐明它们的功能对了解相关肿瘤的发病机制意义重大。

目录

文摘

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论文说明：插图目次 术语及符号缩写清单

声明

致谢

1 引言

2 结肠癌相关芯片靶序列的分析及候选基因psiTPTE22的表达

2.1 芯片靶序列的分析

2.2psiTPTE22基因HERv相关RNA在结肠癌标本中表达水平的检测

2.3 psiTPTE22基因HERV相关RNA在其他标本中表达水平的检测

2.4讨论

3结肠癌相关基因HERV-HX的发现、表达、调控及功能研究

3.1 HERV-HX的发现及全长转录产物的获取

3.2 HERV-HX在结肠癌及其他标本中的转录水平检测

3.3 HERV-HX的结构特征及其与env ORF转录水平的比较

3.4 HERV-HX 5'LTR启动子活性分析

3.5 RNAi实验knock-down HERV-HX

3.6 HERV-HX的knock-down对肠癌细胞HT29基因表达谱的影响

3.7 HERV-HX对肠癌HT29细胞增殖、周期和凋亡的影响

3.8 讨论

4 psiTPTE22-HERV基因的鉴定、表达、调控和功能研究

4.1 基因psiTPTE22与TPTE的比较，以及psiTPTE22-HERV的定义

4.2 psiTPTE22-HERV可变剪接转录产物全长序列的获取

4.3 psiTPTE22-HERV表达水平检测

4.4 psiTPTE22-HERV中HERV元件序列分析及多态性检测

4.5 启动子区BSP检测

4.6 DNA甲基化抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导psiTPT22-HERV的表达

4.7 RNAi实验及psiTPTE22-HERV knock-down对基因表达谱的影响

4.8 psiTPTE22-HERV knock-down对293T胞生长的影响

4.9 psiTPTE22-HERV的表达水平影响293T胞对5氟脲嘧啶的敏感性

4.10 psiTPTE22-HERV蛋白产物的检测

4.11 讨论

5 一个定位于4p15.2的HERV相关基因的发现及表达研究

5.1 一个定位于4p15.2的HERV相关基因的发现及鉴定

5.2 HERV-H4p15.2相关基因在组织标本中的表达

5.3 HERV-H4p15.2相关基因在肿瘤细胞系中的表达

5.4 讨论

6结论

6.1 586-bp芯片序列与结肠癌相关，但与其同源的psiTPTE22基因不是结肠癌相关基因

6.2 HERV-HX是一个新的结肠癌相关基因

6.3 psiTPTE22-HERV是与肾、肝、胃和肺等癌症负相关的功能新基因

6.4 HERV-H4p15.2相关新基因的表达与结肠、胃和肾等癌症负相关

6.5 HERV-HX可能正是586-bp芯片序列检测到的结肠癌相关基因

6.6 三个HERV相关新基因各具特点

参考文献

综述 人内源性逆转录病毒的功能和表达情况

附录

作者简历及在学期间科研成果