小窝蛋白-1在高糖诱导的人晶状体上皮细胞凋亡调控中的作用

摘要

目的：小窝蛋白-1(caveolin-1)参与了上皮细胞(epithelium)凋亡的调控过程，而既往的研究证实晶状体上皮细胞(lens epithelial cells，LECs)凋亡在早期的糖尿病性白内障发病过程中发挥重要的作用。本研究的第一部分，通过高糖干预LECs，观察细胞的凋亡率变化和小窝(caveolae)的分布，Caveolin-1的mRNA水平及蛋白表达变化情况，探讨Caveolin-1与高浓度葡萄糖干预的LECs凋亡之间的关系，以明确Caveolin-1在高糖诱导的LECs凋亡调控中发挥的作用。本研究第二部分，通过研究表皮生长因子(epidermal growth factor， EGF)和辛伐他汀(simvastatin)对高糖干预的LECs的细胞凋亡率和Caveolin-1表达的影响，进一步阐明Caveolin-1与高糖干预的LECs凋亡之间的相关性，为将来研究Caveolin-1与糖尿病性白内障之间的关系，以及糖尿病性白内障的防治奠定基础。
　　 方法：根据文献报道的LECs高糖干预模型，将葡萄糖溶液(5-25 mM)，或将作为渗透压对照的甘露醇(20mM)和葡萄糖(5 mM)的混合溶液加入DMEM培养液，并用该培养液处理人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells，HLECs)的B3系细胞株。收集经过1-48h培养的细胞，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率、实时定量RT-PCR测定Caveolin-1的mRNA表达、Westem blot法分析Caveolin-1蛋白水平、免疫荧光细胞化学法观察Caveolin-1和磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)的表达、透射电镜观察Caveolae的分布。此外，进一步将EGF(0.1 ng/ml)或辛伐他汀(10 nM)和葡萄糖(5或25mM)一起加入DMEM培养液，处理细胞48h，同样使用流式细胞仪检测细胞凋亡率，并用实时定量RT-PCR和Westem blot法评价Caveolin-1的表达水平。
　　 结果：
　　 1.不同浓度的葡萄糖干预，对HLECs凋亡率及Caveolin-1的mRNA表达的影响。
　　 经过5、10、15、20、25mM葡萄糖培养液的48h培养，HLECs的凋亡率随糖的干预浓度增加而明显增加(p<0.05)，而Caveolin-1的mRNA表达水平则明显减少(p<0.01)。其中，25mM葡萄糖干预组HLECs的凋亡率最高，Caveolin-l的mRNA表达水平最低。渗透压对照组的HLECs凋亡率、Caveolin-1的mRNA表达水平与5mM葡萄糖干预组无显著差异(p>0.05)。
　　 2.不同时间的高糖干预，对HLECs凋亡率及Caveolin-1的mRNA表达的影响。
　　 进一步对高糖(25mM葡萄糖)干预下，HLECs的凋亡率和Caveolin-l的mRNA表达水平与干预时间的相关性进行研究，发现经过1-48h培养，对照组HLECs的凋亡率及Caveolin-1的mRNA表达水平无明显增加(p>0.05)，而从12h开始，高糖干预组的HLECs的凋亡率随培养时间增加而明显增加(p<0.05)，Caveolin-1的mRNA表达水平则明显下降(P<0.05)。
　　 3.高糖对HLECs的Caveolin-I蛋白表达的影响。
　　 此外，与我们检测到的Caveolin-1的mRNA表达的变化趋势类似，Westem blot的结果显示，经48h的培养，HLECs的Caveolin-I蛋白表达随干预的糖浓度增加而明显减少(P<0.05)，渗透压对照组则与5mM对照组蛋白表达相近(p>0.05)。而在高糖干预1-48h的时间相关性实验中，从24h开始，高糖干预组的HLECs随着培养时间的延长，Caveolin-1蛋白表达也逐渐减少(P<0.05)。
　　 4.免疫荧光染色和透射电镜观察。
　　 在免疫荧光细胞化学实验中，与对照组细胞相比，高糖干预组的Caveolin-1荧光染色强度明显下降，说明Caveolin-1蛋白表达下降。另外，从细胞膜的胞浆侧外翻到细胞膜外侧的PS染色阳性的细胞数明显增加，说明细胞的凋亡率增加。透射电子显微镜观察发现，高糖干预使HLECs的Caveolae分布明显减少。
　　 5.辛伐他汀和EGF对高糖干预HLECs凋亡率及Caveolin-1表达的影响。
　　 辛伐他汀和EGF可以明显增加高糖干预组的Caveolin-1 mRNA的水平(p<0.01)，同时使HLECs凋亡率明显降低(p<0.05)。辛伐他汀和EGF都可以使，高糖培养HLECs的Caveolin-1蛋白表达水平，明显增高到接近SmM葡萄糖对照组的水平。
　　 结论：
　　 1.本研究首次联合应用实时定量RT-PCR法、Westem-blot法、免疫荧光细胞化学法和透射电镜法，对高糖培养的HLECs进行Caveolin-1表达和Caveolae的分布的分析，发现HLECs的Caveolin-1表达和Caveolae的分布明显受到环境中糖浓度的影响，高浓度的葡萄糖使Caveolin-1表达降低，Caveolae分布减少。研究结果提示，HLECs的Caveolin-1结构，参与了细胞对高糖刺激的反应过程。
　　 2.本研究首次将Caveolin-1蛋白，引入了对高糖诱导的HLECs凋亡实验研究中，并发现高糖干预使HLECs的Caveolin-I表达下降，而细胞凋亡增加，两者存在相关性。这就明确了，Caveolin-1在高糖诱导HLECs凋亡过程中发挥作用，并可能参与凋亡的调控过程。这还为将来，进一步根据糖尿病引起的LECs凋亡可以导致糖尿病性白内障的既往研究结果，深入研究Caveolin-1与糖尿病性白内障形成的关系奠定基础。
　　 3.本研究使用临床上常见的辛伐他汀和EGF两种药物干预高糖培养的HLECs，发现两者都使HLECs的Caveolin-1表达增加，而细胞凋亡率减少，并且细胞Caveolin-1表达和凋亡率都恢复到接近正常组的水平。说明HLECs在高糖干预情况下，Caveolin-1表达的变化与的LECs凋亡存在相关性。鉴于人为控制干预因素，来影响LECs凋亡过程，在防治糖尿病性白内障以及后发性白内障的发生发展中，所起的重要作用。本研究，为将来进一步深入研究Caveolin-1与糖尿病性白内障及后发性白内障的形成机制的关系及其防治，提供了思路。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

致谢

1引言

2第一部分高浓度葡萄糖诱导人晶状体上皮细胞凋亡与小窝蛋白-1表达的相关性

2.1前言

2.2技术线路

2.3材料与方法

2.4结果

2.5讨论

2.6小结

3第二部分小窝蛋白-1表达上调对高糖诱导的人晶状体上皮细胞凋亡的影响

3.1前言

3.2技术线路

3.3材料与方法

3.4 结果

3.5讨论

3.6小结

4 结论

参考文献

综述 小窝及其在眼科中的研究进展

作者简历及在读期间所取得的科研成果