硫醇转移酶在高糖诱导的人晶状体上皮细胞氧化应激中的表达和作用研究

摘要

目的:
　　硫醇转移酶(Thioltransferase,TTase),是细胞质内的一种小分子蛋白,它能够特异性地催化还原硫醇化的蛋白质,使其二硫键断裂,对于晶状体内氧化还原平衡状态的维持具有重要的作用。高浓度葡萄糖可通过多种途径诱发氧化应激,最终导致糖尿病性白内障的形成。本研究旨在观察TTase在高糖培养的人晶状体上皮细胞(HLE B3)中的表达和活性,初步探讨TTase在对抗高糖诱导的氧化应激中可能的作用及机制,为阐明糖基化和氧化损伤修复的相互作用奠定基础。本实验第一部分观察了不同浓度葡萄糖作用不同时间对体外培养的人晶状体上皮细胞TTase表达和活性的影响,第二部分利用RNA干扰技术手段使人晶状体上皮细胞TTase表达下调,在此基础上给予高糖孵育,测定并比较人晶状体细胞内ROS、GSSG含量、SOD和CAT活性变化和细胞凋亡情况,探讨TTase可能的作用机制。
　　方法:
　　1.将人晶状体上皮细胞用含不同浓度的葡萄糖(5.5mmol/L,25.5mmol/L,35.5mmol/L和45.5mmol/L,其中5.5mmol/L设为正常对照组,其余三个浓度设为高糖组),胎牛血清体积分数为10％的DMEM培养液培养,并设立各浓度高糖相应渗透压的甘露醇高渗对照组,分别于1d,2d,3d,4d收集细胞,提取细胞总RNA,用qRT-RCR技术检测TTase mRNA含量。根据不同浓度高糖实验结果,选择35.5mmol/L高糖为实验高糖浓度,Western blot检测细胞在该高糖浓度培养下1～4d TTase的表达,并测定TTase活性。
　　2.利用脂质体法将TTase siRNA转染人晶状体上皮细胞,测定转染及干扰效率,筛选最佳siRNA作为后续实验用。设立正常对照组,高糖组,TTase RNA干扰组和TTase RNA干扰+高糖组,3d后测定细胞内TTase活性,ROS含量,GSSG/T-GSH,SOD和CAT活性,流式细胞术检测细胞凋亡情况。
　　结果:
　　1.在同一浓度的高糖培养液中,TTase mRNA含量在2d内逐渐增高,2d后开始下降。在25.5mmol/L高糖培养中,TTase在1～3d的mRNA含量分别为正常对照的2.53,6.06,3.33倍,差异均有统计学意义(P<0.05),4d时降至正常水平(P>0.05);在35.5mmol/L高糖培养中,TTase在1～3d的mRNA含量分别为正常对照的6.24,9.28,3.12倍,差异均有统计学意义(P<0.05),4d时降至正常水平(P>0.05);在45.5mmol/L高糖培养中,TTase mRNA含量虽然在1d和3d较正常对照增高,但差异无统计学意义(P>0.05),在2d时为正常对照的6.01倍,差异有统计学意义(P<0.05),4d时降至正常水平(P>0.05)。各高糖浓度对应的甘露醇高渗对照组TTase mRNA含量与正常对照组相比无显著性差异(P>0.05)。Western blot结果显示TTase表达在1～4d逐渐增强,从2d开始与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。正常对照组TTase活性为6.69±0.47mU/mg protein,在35.5mmol/L高糖培养中,1～4d TTase活性先逐渐增强,随后又降低,分别为8.37±1.24,10.19±0.66,11.23±1.75,10.50±0.70mU/mg protein,2～4d时TTase活性与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。
　　2.流式细胞仪检测荧光标记的siRNA平均转染效率为81%,筛选出的最佳TTase siRNA可使晶状体上皮细胞TTase表达降至正常对照的39.5%(P<0.05)。在正常对照组、高糖组、TTase RNA干扰组和TTase RNA干扰+高糖组中,细胞TTase活性分别为6.68±0.47,11.23±1.75,3.58±0.70,5.49±1.15mU/mg protein,与正常对照组相比,高糖组细胞内TTase活性升高(P<0.01),TTase RNA干扰组TTase活性降低(P<0.05),TTase RNA干扰+高糖组与正常对照组比较无显著性差异(P>0.05);正常对照组、高糖组、TTase RNA干扰组和TTase RNA干扰+高糖组的细胞ROS含量测定结果分别为155.70±11.50,186.33±11.59,219.00±11.00,265.33±16.50相对荧光单位,RNA干扰+高糖组细胞内ROS含量最高,与其他各组相比差异有统计学意义(P<0.05);正常对照组、高糖组、TTase RNA干扰组和TTase RNA干扰+高糖组的GSSG/T-GSH结果分别为:(3.81±1.08)%,(8.97±0.95)%,(10.96±1.28)%,(14.15±1.48)%,RNA干扰+高糖组细胞内GSSG/T-GSH最高,与其他各组相比差异有统计学意义(P<0.05);正常对照组、高糖组、TTase RNA干扰组和TTase RNA干扰+高糖组细胞的SOD活性测定结果分别为114.80±9.49,88.17±7.92,69.65±7.23,47.15±5.41U/mg protein,CAT活性测定结果分别为12.13±1.39,8.33±1.14,6.04±0.64,4.46±0.74 U/mg protein,TTase RNA干扰+高糖组细胞SOD和CAT活性与其他组比较均有显著性降低(P<0.05),但各实验组细胞凋亡均不明显,凋亡率差异无显著性(P>0.05)。
　　结论:
　　高浓度葡萄糖可使体外培养的人晶状体上皮细胞ROS含量增加,诱发氧化应激,细胞内GSH含量减少,GSSG含量增加,抗氧化酶SOD和CAT活性受损,高糖使TTase的表达与活性适应性增强,参与对抗高糖诱导的氧化应激,其作用机制可能为增加GSH含量,降低GSSG含量,修复受损的抗氧化酶,从而降低ROS含量,维持细胞内氧化还原状态的平衡。

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缩略语表

中文摘要

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前言

文献回顾

一、糖尿病性白内障及其发病机制

二、晶状体的氧化还原平衡

三、TTase及其研究进展

四、糖尿病性白内障防治现状

实验一 高浓度葡萄糖对人晶状体上皮细胞TTase表达的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 TTase在高糖诱导的人晶状体上皮细胞氧化应激中的作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢