小白菜硫代葡萄糖苷含量及芳香族硫苷合成相关基因CYP79A2的克隆

摘要

硫代葡萄糖苷是一种广泛存在于十字花科植物中的重要含氮、硫次生代谢物。由于其在黑芥子酶作用下的降解产物异硫代氰酸盐有生物防御、抗菌及抗癌等作用，日益受到人们的重视。
　　 本论文研究了小白菜杭州油冬儿在不同生长期不同部位的硫苷含量变化，以及7个品种小白菜地上部和根系的硫苷含量，并且成功克隆到在芳香族硫苷合成过程中的关键基因CYP79A2。
　　 在小白菜中共检测到7种硫苷，分别是5-甲基亚磺酰戊基硫苷、3-丁烯基硫苷、4-戊烯基硫苷、吲哚-3-甲基硫苷、2-苯乙基硫苷、4-甲氧基吲哚-3-甲基硫苷、1-甲氧基吲哚-3-甲基硫苷。实验发现不同生长期的硫苷含量存在差异，硫苷含量一般随着生长时间先升高后降低，因此为获得高硫苷含量的小白菜需适时收获。叶片和叶柄的硫苷含量和种类较为相似，在叶片和叶柄都中含有大量的脂肪族硫苷，在根部芳香族硫苷占绝对多数。不同品种小白菜硫苷含量存在差异，但在各品种中地上部的脂肪族硫苷含量都高于根部，吲哚族和脂肪族则是根部高于地上部，可以通过品种选育的方法来获得高含量目标硫苷的品种。
　　 根据拟南芥和大白菜CYP79A2基因的序列设计特异性引物，从小白菜品种杭州油冬儿中提取到的RNA克隆到小白菜CYP79A2的cDNA序列，其编码区为1572 bp，推导的蛋白质有523个氨基酸，分子量为59.33 kDa，目前在Genebank只找到拟南芥和大白菜存在同源基因，与本实验克隆到的基因相比，相似性分别为85.42％和96.98％。CYP79A2在硫苷合成过程中将芳香族氨基酸转化成乙醛肟，因此在芳香族硫苷合成过程中起着关键作用，此基因的克隆为将来利用基因工程手段提高芳香族硫苷提供了可能。

目录

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致谢

第一章 文献综述

1.1小白菜

1.2硫苷的研究进展

1.2.1硫苷的分布与含量

1.2.2硫苷的分类与结构

1.2.3硫苷的生物合成

1.2.4硫苷的降解

1.2.5硫苷降解产物的生物功能

第二章 不同生长期小白菜硫苷含量变化研究

2.1材料与方法

2.1.1仪器与试剂

2.1.2实验材料

2.1.3测定方法

2.1.4统计分析

2.2结果与分析

2.2.1不同生长期小白菜叶片、叶柄和根部生物量的变化

2.2.2不同生长期小白菜叶片、叶柄和根部硫苷的含量

2.2.3不同生长期小白菜不同部位硫苷的含量及比较

2.2.4不同生长期小白菜不同种类硫苷的含量及比较

2.2讨论

第三章 不同品种小白菜硫苷含量差异研究

3.1材料与方法

3.2结果与分析

3.2.1不同品种小白菜地上部和根部生物量的变化

3.2.2不同品种小白菜地上部和根部硫苷的含量

3.2.3不同品种小白菜不同部位硫苷的含量及比较

3.2.4不同品种小白菜不同种类硫苷的含量及比较

3.3讨论

第四章 小白菜芳香族硫苷合成相关基因CYP79A2的克隆

4.1实验材料

4.1.1植物材料

4.1.2菌株与质粒

4.1.3酶及生化试剂

4.2实验方法

4.2.1小白菜无菌苗的培养

4.2.2 RNA的提取

4.2.3反转录合成cDNA第一条链

4.2.4引物的设计及PCR扩增

4.2.5凝胶的回收

4.2.6目的片段的连接

4.2.7感受态细胞的制备

4.2.8连接产物的转化

4.2.9质粒DNA的提取

4.2.10质粒的酶切鉴定

4.2.11序列的测定

4.3结果与分析

4.3.1总RNA的提取

4.3.2小白菜CYP79A2编码序列的分析

4.3.3小白菜CYP79A2推导的蛋白质分析

4.4讨论

参考文献