我国六种双生病毒的分子鉴定及两种病毒的致病性研究

摘要

双生病毒是植物病毒中唯一一类具有孪生颗粒形态的单链DNA病毒,已在多个国家和地区的多种重要经济作物上造成毁灭性危害。自20世纪90年代起,我国的云南、广东、广西、海南和台湾等地的作物及杂草上已相继发现了多种双生病毒.为进一步了解双生病毒在我国的种类、分布及危害,本论文对我国江苏,浙江和云南地区发生的双生病毒进行了分子鉴定并对部分病毒进行了致病性研究。
　　 从江苏宜兴采集了2份表现黄花叶症状的苎麻样品(J4和J5),从浙江余杭采集了1份表现黄花叶症状的苎麻样品(Z1),利用双生病毒特异性引物PA/PB扩增得到约500 bp的DNA-A部分片段,其核苷酸序列相似性为91.6-99.2％。选择代表性分离物J4和Z1进行全序列测定,结果显示J4和Z1 DNA-A全长分别为2736和2737 nts(登录号FN396969和FN396971)。利用PCR检测到DNA-B组份,J4和Z1 DNA-B全长分别为2717和2719 nts(登录号FN396970和FN396972)。核苷酸序列比较表明,J4和Z1 DNA-A相似性为94.7％,DNA-B相似性为88.6％。J4和Z1的两个组份都与苎麻花叶病毒(Ramie mosaic virus,RamMV)不同分离物的相似性最高,DNA-A之间的相似性为93.6-94.7％,DNA-B之间的相似性为90.6-91.2％。因此,认为J4和Z1是RamMV的两个不同分离物。这是首次在江苏和浙江地区报道双组份双生病毒。
　　 从江苏宜兴采集的表现黄花叶症状的大青样品(YX1,YX2和YX3)中分离出两种双生病毒。利用双生病毒特异性引物PA/PB对3个分离物扩增的约500 bp片段的核苷酸序列相似性为59.8-99.4％,确定3个大青样品中都存在两种双生病毒复合侵染。随机选择YX2分离物扩增两种病毒全长基因组DNA-A,序列测定表明YX2-Ⅰ和YX2-Ⅱ全长分别为2753和2775 nts(登录号FN396966和FN396962),它们之间的核苷酸序列相似性仅为68.2％。与其它已报道的双生病毒进行比较发现,YX2-Ⅰ与软枝黄婵曲叶病毒(Allamanda leaf curl virus,AILCV)的分离物AILCV-[CN:G10:06]的相似性最高,为79.7％;YX2-Ⅱ与中国大青金色花叶病毒(Clerodendrum golden mosaic China virus,CIGMCNV)的分离物C1GMCNV-[CN:FZ7:08]的相似性最高,为93.0％。根据双生病毒“种”的分类标准,YX2-Ⅰ是一个双生病毒新种,将其命名为江苏大青金色花叶病毒(Clerodendrum golden mosaic Jiangsu virus,C1GMJSV);而YX2-Ⅱ为CIGMCNV的一个分离物。利用RCA-RFLP鉴定出与YX2-Ⅱ伴随的DNA-B组份,基因组全长为2728鹏(登录号FN396963),证实YX2-Ⅱ是一个双组份双生病毒。利用PCR检测方法,未能在3个样品中发现卫星分子DNAβ的存在。为进一步验证CIGMJSV和C1GMCNV的致病性,分别构建了两种病毒的侵染性克隆,发现C1GMJSV单独接种即可在本氏烟、心叶烟、三生烟、矮牵牛和番茄上诱导典型的病害症状,并能和异源病毒的卫星分子(Tobacco curly shoot betasatellite,TbCSB)在本氏烟中致病;对C1GMCNV的致病性测定表明,C1GMCNV DNA-A单独可以系统侵染本氏烟、心叶烟和三生烟等寄主植物,但是其不足以诱导典型的病害症状,而CIGMCNV DNA-A+DNA-B混合接种时能在本氏烟、心叶烟和三生烟中诱导产生双生病毒侵染的典型症状.此外,双组份双生病毒C1GMCNVDNA-A能够与TbCSB在本氏烟和心叶烟中进行功能互作。
　　 从云南宝山采集了2份表现为黄脉症状的黄花稔样品(Y340和Y341),利用双生病毒特异性引物PA/PB扩增得到约500 bp片段。对这些片段进行克隆和测序发现,Y340dP存在两种双生病毒复合侵染(Y340-Ⅰ和Y340-Ⅱ);而Y341感染了一种双生病毒,并且与Y340-Ⅰ属于同一类型。Y340-Ⅰ和Y341 DNA-A全长均为2750nts(登录号FN806777和FN806778),与洋麻曲叶病毒(Kenaf leaf curl.virus,KeLCuV)不同分离物具有最高的核苷酸序列相似性,为90.5-91.0％,根据双生病毒分类原则,Y340-Ⅰ和Y341为KeLCuV的两个不同分离物;Y340-Ⅱ DNA-A全长为2745 nts(登录号FN806779),其与赛葵黄脉病毒(Malvastrumyellow veinvirus,MaYVV)不同分离物和宝山赛葵黄脉病毒(Malvastrumyellow vein Baoshanvirus,MaYVBsV)不同分离物的核苷酸序列相似性均较高,分别为87.2-89.7％和88.5-89.2％,但系统关系分析表明Y340-Ⅱ与MaYVBsV的亲缘关系更近,因此,将Y340-Ⅱ暂定为MaYVBsV的一个分离物。这也是首次报道KeLCuV和MaYVBsV侵染黄花稔寄主。重组分析发现,Y340-Ⅰ和Y340-Ⅱ可能是由重组产生的。进一步利用PCR检测发现,Y340和Y341样品中都含有卫星分子DNAI},全长分别为1342和1341 nts(登录号FN806780和FN806781),核苷酸序列比对后发现均与云南赛葵黄脉病毒卫星分子DNAβ(Malvastrumyellow vein Yunnan betasatellite,MaYVYnB)不同分离物的相似性最高,达81.7-83.4％。根据双生病毒DNAβ种的划分标准,Y340β和Y341β属于MaYVYnB的两个不同分离物。在Y340样品中还分离到了DNA1分子,Y340 DNA1全长为1370 nts(登录号FN806782),与其它已报道的DNA1分子的核苷酸序列相似性相对较高,为61.4-82.2％,而与矮缩病毒属病毒(nanoviruses)的相似性仅为28.4-30.0％。
　　 从采自云南瑞丽地区表现黄脉症状的锐叶牵牛样品(Y335-338)中分离到了双生病毒。利用双生病毒简并引物BegoAFor1/BegoARev1对4个分离物扩增的约1.2 kb片段的相似性为97.9-99.5％。随机选择Y338分离物进行全序列测定(登录号FN806776)及检测分析,发现样品中只含有单组份双生病毒,并且与云南地区报道的甘薯卷叶病毒(Sweet potato leaf curl virus,SPLCV)分离物SPLCV-[CN:RL31:07]的相似性最高,为97.8％,因此认为Y335-338属于SPLCV的不同分离物。该类病毒在亲缘关系上与旧世界双生病毒更为接近,但是它们在进化树上形成相对独立的分支。