第一部分：半胱氨酰白三烯受体对缺氧缺糖损伤中大鼠星形胶质细胞水通道蛋白4表达的调节；第二部分：新型半胱氨酰白三烯受体GPR17的多克隆抗体制备及其鉴定

摘要

目的：⑴探讨CysLT受体对缺氧缺糖损伤/恢复(OGDIR)后，星形胶质细胞水通道蛋白4( AQP4)表达及细胞损伤的调节作用，以及可能的信号通路。⑵制备新型半胱氨酰白三烯受体GPR17的多克隆抗体(pAb)，并鉴定其免疫学特性。
　　 方法：①以MTT及LDH法，检测不同时间OGD后恢复24 h对原代培养大鼠星形胶质细胞活性的影响，确定合适的时间点制作OGD/恢复(OGD/R)诱导损伤的模型；②以RT-PCR及免疫组化法，检测该条件下大鼠星形胶质细胞CysLT1及CysLT2受体的表达情况；③以MTT及LDH法，检测CysLT受体拮抗剂对OGD/R引起原代培养星形胶质细胞损伤的作用，并以Western blot及免疫组化法，检测对AQP4表达的影响；④以AQP4 siRNA抑制AQP4表达，进一步确定AQP4在OGD/R损伤中的作用；⑤最后，以Westem blot法检测MAPK通路的激活，并观察MAPK抑制剂对OGD/R诱导的星形胶质细胞的损伤及其对AQP4表达的影响。⑥以KLH偶联的GPR17多肽免疫家兔制备其pAb，用间接ELISA法测定抗体效价，阻断ELISA测定抗体敏感性及特异性，同时以新制备的抗体做Westem blot，检测GPR17的组织表达。
　　 结果：⑴原代培养大鼠星形胶质细胞随OGD时间的延长，损伤逐步加重，在OGD4h/恢复24 h(OGD4 h/R24 h)时细胞存活率在65％～70％左右，将此条件作为后续实验的损伤条件。正常培养条件下，星形胶质细胞有CysLT1受体的表达，而CysLT2受体表达很弱，OGD4 h/R24 h后，CysLT1受体的表达基本不变，而CysLT2受体表达明显增强。OGD4 h/R24 h诱导的星形胶质细胞的损伤，可被CysLT2受体选择性拮抗剂BaycysLT2(1μM)及受体非选择性拮抗剂Bayu9773(1μM)所拮抗，而不被CysLT1受体选择性拮抗剂孟鲁司特(1μM)所拮抗，证明CysLT2受体介导OGD4 h/R24 h诱导的星形胶质细胞损伤。同时OGD4 h/R24 h后AQP4的表达上调，并且这种作用同样可被CysLT2受体拮抗剂而非CysLT1受体拮抗剂所抑制。AQP4 siRNA抑制AQP4表达，并减轻OGD4 h/R24 h诱导的细胞损伤，进一步证明OGD过程中AQP4的表达增加，加重细胞损伤。同时，OGD4 h/R24 h损伤后ERKI/2、p38被激活，并且ERK1/2、p38的抑制剂能够拮抗OGD4 h/R24 h诱导的细胞损伤及AQP4上调。⑵通过免疫家兔获得的抗GPR17 pAb，ELISA测定显示其抗体效价最高可达到1/16364，并对CysLT1受体和CysLT2受体基本无交叉反应，具有较好的特异性。Westem blot结果显示，GPR17在大鼠脑和心脏组织中有较高的表达，其分子量在43 kD左右。
　　 结论：①CysLT2受体介导OGD4h/R24 h诱导的星形胶质细胞损伤。②OGD4 h/R24 h后，CysLT2受体介导AQP4表达上调，这种上调加重OGD4 h/R24 h诱导的细胞损伤。③ERK1/2、p38 MAPK激活参与调节CysLT2受体介导的星形胶质细胞AQP4表达上调及OGD4 h/R24 h损伤。④制备的GPR17 pAb具有较高的效价和较好的特异性，能满足Westem blot检测GPR17的要求。

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致谢

第一部分半胱氨酰白三烯受体对缺氧缺糖损伤中大鼠星形胶质细胞水通道蛋白4表达的调节

1.引 言

2.实验材料

3.实验方法

4.实验结果

5.讨 论

第一部分结论

参考文献

第二部分新型半胱氨酰白三烯受体GPR17的多克隆抗体制备及其鉴定

1.引 言

2.实验材料

3.实验方法

4.实验结果

5.讨 论

参考文献

综述 水通道蛋白4在脑功能调节中作用的研究进展

作者简历及已发表论文