FCM法评价铅接触致DNA损伤及某海岛人群DNA损伤率调查

摘要

铅是广泛存在环境中的对人体有害的物质，随着现代工业的发展，铅的应用越来越广泛，职业性铅中毒成为常见的职业病之一，因此预防职业性铅中毒的发生显得尤为重要。有关铅的遗传毒性研究已有定论：研究表明铅具有明显的遗传毒性，高浓度时有直接诱变性，表现为致裂作用(clastogenesis)，低浓度时可通过干扰DNA的损伤修复而产生协同诱变性，铅的遗传毒性不仅有动物实验结果，应用单细胞凝胶电泳实验(又叫彗星实验)检测职业铅接触工人外周血细胞DNA损伤效应也有文献报道。传统检测DNA损伤的方法多用单细胞凝胶电泳实验和微核试验，其检测的指标是细胞对遗传毒性物质反应的最后结果，较难早期、灵敏的反映遗传毒性物质对细胞DNA的作用，且对于现场人群大样本的操作存在着一定的局限性，所以需要探讨一种更为客观、简便、有效的用于现场人群大样本的检测手段。γH2AX是目前国内外研究细胞DNA损伤应激反应的热点之一，当发生DNA双链断裂，组蛋白H2A家族成员中的H2AX第139位丝氨酸残基迅速磷酸化，形成磷酸化的H2AX，即γH2AX，在断裂位点募集损伤修复相关蛋白簇集，在荧光显微镜下清楚可辨绿色的荧光，即焦点，这一过程可在几分钟之内发生。进一步研究证明γH2AX焦点形成的数量与IR(电离辐射)、其他致癌、致突变化学物造成DSBs数量上呈一一对应关系，被公认为是一种可灵敏地检测DSBs的有效指标。γH2AX识别抗体流式细胞术(FCM)是DSBs检测的一项新技术，是DNA损伤修复、细胞周期的调节点等研究的一种非常有用的工具，具有快速、客观的优点。本研究采用γH2AX识别抗体流式细胞术(FCM)检测铅接触工人的DNA损伤，选择某蓄电池厂工人作为接触组。由于铅主要是通过铅尘、铅烟造成空气污染，并影响到接铅工厂附近的水、土壤、食物，使其铅含量升高；另该蓄电池厂非接触铅作业人员数很少，选择厂内对照意义不大，故本课题选择远离蓄电池厂的某海岛人群作为厂外对照，调查该海岛人群外周血淋巴细胞DNA损伤率，同时对可能造成非职业接触有害因素人群DNA损伤的相关因素进行分析。
　　 目的：⑴应用γH2AX识别抗体流式细胞术(FCM)检测铅接触工人外周血淋巴细胞DNA的损伤作用，通过对不同铅职业暴露水平、不同工种、不同工龄等相关因素的DNA损伤的分析，探讨职业铅接触的遗传毒性。⑵应用γH2AX识别抗体流式细胞术(FCM)检测某海岛非职业接触有害因素人群(以下简称海岛人群)外周血淋巴细胞DNA损伤率和几何平均荧光强度，通过对不同性别、年龄、吸烟、饮酒等相关因素的DNA损伤的分析，探讨非取业接触有害因素人群DNA损伤与上述相关因素的关系。
　　 方法：①选择某蓄电池厂41例职业铅接触工人作为接触组，某海岛非职业接触有害因素人群175例作为外对照。调查研究对象的年龄、性别、吸烟、饮酒等一般流行病学资料。从体检报告中获取41例职业铅接触工人的血铅、尿铅、d-ALA等生物学资料。同时调查该蓄电池厂生产环境，检测空气中铅浓度。②每个研究对象肝素抗凝管采集静脉血约3ml，移动冰箱保存运回实验室处理。血：人淋巴细胞分离液=1：1，水平离心机2000r*30min，分离得到淋巴细胞。分离后的淋巴细胞用75％冰乙醇制成2ml悬液，分成2管，固定后可于-20℃保存。待检测时水平离心机2000r*10min，吸去上清液，加入羊血清工作液100μl室温封闭2h，PBS洗涤一次，FITC标记的抗γH2AX抗体(1：500)避光室温孵育2h，PBS洗涤一次，制成400μl PBS悬液，上流式细胞仪检测。③对接触组和对照组的DNA损伤情况及年龄、性别、吸烟、饮酒、血铅、尿铅、d-ALA等资料进行统计分析，探讨铅的遗传毒性和非职业接触有害因素人群DNA损伤与上述相关因素的关系。
　　 结果：⑴该蓄电池厂铅作业环境空气中铅浓度检测结果表明只有焊组(铅接触高浓度组)空气中铅浓度超过国家职业接触限值，包片(又叫装配)、称片、封盖、大小包装、配组、充电(铅接触中、低浓度组)空气中铅浓度检测低于国家职业接触限值。⑵不同职业暴露水平铅接触组工人外周血淋巴细胞DNA损伤率和几何平均荧光强度明显高于对照组，差异有统计学意义(p<0.05)；不同铅接触工龄组工人外周血淋巴细胞DNA损伤率和几何平均荧光强度差异无统计学意义(p>0.05)；接触组工人DNA损伤率与血铅、尿铅、d-ALA等因素经多重线性回归分析，未见有统计学意义(p>0.05)，几何平均荧光强度与血铅、尿铅、d-ALA等因素经多重线性回归分析，未见有统计学意义(p>0.05)；采用偏相关分析分别分析不同铅职业暴露水平组工人的DNA损伤情况(DNA损伤率和几何平均荧光强度)与血铅、尿铅、d-ALA等因素的相关性，结果表明高浓度组DNA损伤率与血铅、d-ALA呈正相关，高浓度组几何平均荧光强度与血铅呈正相关，相关系数r有统计学意义(p<0.05)。⑶海岛人群DNA损伤率的调查：不同性别组人群外周血淋巴细胞几何平均荧光强度差异有统计学意义(p<0.05)；不同年龄组人群几何平均荧光强度差异有统计学意义(p<0.05)；不同饮酒史人群几何平均荧光强度差异有统计学意义(p<0.05)；不同吸烟史人群DNA损伤率和几何平均荧光强度差异无统计学意义(p>0.05)；采用偏相关分析分别分析DNA损伤率、几何平均荧光强度与性别、年龄、饮酒史、吸烟史的相关性，结果表明DNA损伤率、几何平均荧光强度与饮酒史呈正相关，相关系数有统计学意义(p<0.05)，DNA损伤率、几何平均荧光强度与性别、年龄、吸烟史的相关性无统计学意义(p>0.05)。
　　 结论：①职业性铅接触可引起人体外周血淋巴细胞DNA损伤，不同职业暴露水平铅接触工人外周血淋巴细胞DNA损伤率和几何平均荧光强度明显高于对照组，差异有统计学意义(p<0.05)；但未见不同工龄组工人DNA损伤有统计学差异。DNA损伤情况(DNA损伤率和几何平均荧光强度)与血铅、尿铅、d-ALA等因素经多重线性回归分析无统计学意义(p>0.05)。各不同铅职业暴露水平组工人的DNA损伤情况与血铅、尿铅、d-ALA等因素经偏相关分析，结果表明高浓度组DNA损伤率与血铅、d-ALA呈正相关，高浓度组几何平均荧光强度与血铅呈正相关，相关系数r有统计学意义(p<0.05)。②γH2AX识别抗体流式细胞术是一种检测外周血淋巴细胞DNA损伤的客观、敏感、有效的方法。不同性别、不同年龄、不同饮酒史的某海岛人群几何平均荧光强度差异有统计学意义，但未见DNA损伤率差异的统计学意义。某海岛人群DNA损伤率、几何平均荧光强度与相关因素(即性别组、年龄组、吸烟史分组、饮酒史分组)经偏相关性分析，结果表明DNA损伤率、几何平均荧光强度只与饮酒史呈正相关。相关系数有统计学意义，DNA损伤率、几何平均荧光强度与性别、年龄、吸烟史的相关性无统计学意义(p>0.05)。

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参考文献

综述 评估铅接触致DNA损伤的研究进展和新指标的应用前景

作者简历及在读期间所取得的科研成果