Nrf2-ARE信号通路在肿瘤耐药中的作用及相关机理的研究

摘要

论文分为二部分，主要内容如下：
　　 第一部分构建Nrf2低表达的稳定细胞株，用于Nrf2小分子抑制剂作用机制的研究。采用shRNA-Nrf2转染A549、H460细胞，通过Westernblotting、还原型谷胱甘肽(reduced-glutathione，GSH)检测得到Nrf2低表达的稳定细胞株A549-C27、H460-C9和H460-C13。在A549-C27中，小分子抑制剂木犀草素(Luteolin)作用后，GSH无显著性降低，同时对抗癌药物的抗细胞增殖作用无明显增强，而在对照组细胞中Luteolin可显著增强抗癌药物的作用。因此，Nrf2很可能是Luteolin增敏肿瘤细胞的重要靶点。在H460-C9和H460-C13细胞株中，MTS结果表明，抗癌药物奥沙利铂(Oxaliplatin)、阿霉素(Doxorubicin)和博来霉素(Bleomycin)的抗细胞增殖作用明显增强。建立Nrf2低表达的稳定细胞株，不仅可用于耐药性的研究，而且为Nrf2小分子抑制剂的研究提供便捷途径。
　　 第二部分，进一步研究奥沙利铂对结肠癌细胞Caco2中Nrf2-ARE信号转导通路的作用及相关机理。奥沙利铂作用后，采用检测荧光素酶活性、Westernblotting、实时荧光定量PCR(Real-timePCR)等方法分析Nrf2调控的基因AKRlCl、NQO1、HO-1等蛋白质表达及mRNA水平升高；进一步检测GSH合成增加，活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)水平降低。这些结果表明奥沙利铂可激活Nrf2-ARE信号通路。在此，对其作用机制进行研究：染色质免疫共沉淀(Chromatinimmunoprecipitation，ChIP)法分析表明，奥沙利铂可增强Nrf2的转录活性；实时荧光定量PCR分析显示，在Keapl过量表达的A549-Cl细胞株中，奥沙利铂可诱导HO-1的mRNA水平，这一结果表明，奥沙利铂激活Nrf2需要Keap1参与；Westernblotting检测发现奥沙利铂可以诱导MAPK信号通路中ERK的磷酸化进而激活Nrf2，通过检测双荧光素酶活性发现ERK磷酸化抑制剂UO126可以抑制奥沙利铂的诱导作用。本结果不仅为Nrf2-ARE信号通路与肿瘤耐药性研究奠定了基础，也可能对奥沙利铂的临床应用具有指导意义。

目录

文摘

英文文摘

声明

致谢

引言

1材料

1.1主要试剂

1.2主要溶液配制

1.3主要仪器

2实验方法

2.1细胞培养

2.2稳定细胞株的建立

2.3Western blotting

2.4还原型谷胱甘肽(reduccd-glutathione,GSH)检测

2.5 MTS检测法

2.6荧光素酶活性检测

2.7双荧光素酶(Dual-Luciferase)活性检测

2.8实时荧光定量PCR(Real-time PCR)

2.9活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测

2.10染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)

2.11统计处理

3实验结果与讨论

3.1Nrf2-ARE在非小细胞肺癌(NSCLC)A549和H460耐药中的作用研究

3.2奥沙利铂激活Nrf2-ARE信号通路的机理研究

4参考文献

5综述Nrf2-ARE信号通路与肿瘤发生及耐药性的关系

6作者简历及在读期间所取得的科研成果