非脊椎动物Kv2基因A至I RNA编辑位点的鉴定和形成机制的初步研究

摘要

RNA编辑的分子机制和生理功能的研究已经非常广泛，但其在生物进化过程中的意义仍然是一个谜团。本研究从约占动物界总种数85％的节肢动物门出发，通过基因组序列与RT-PCR序列的比对，鉴定Kv2基因第二外显子A至I RNA编辑靶位点。结果发现，尽管各物种所在纲和目不尽相同，进化年代上也相差甚远，但是却有三个编辑位点Y/C，S/G，I/V是非常保守的，表明这种修饰对蛋白质的功能是有重要作用的。不仅如此，同一个目或同一个纲亲缘关系相近的物种，往往会共享一些编辑位点，同时保留一些自己特有的编辑位点。
　　 A至I RNA编辑酶ADAR作用的底物一般认为是由外显子与其下游内含子的一小段序列回折形成的双链RNA，而根据本研究对节肢动物门中模式生物家蚕(Bombyx mori)、果蝇(Drosophila melanogaster)、意大利蜜蜂(Apis mellifera)二级结构的预测，发现这些物种Kv2基因的exon2这段序列自身就可以形成完美的RNA编辑结构。由此运用细胞转染的方法建立了一套体内编辑系统来验证这一预测。结果显示果蝇的Kv2基因片段发生编辑，但家蚕和意大利蜜蜂的不能被编辑。继而我们推断果蝇的Kv2基因编辑是由exon2自身形成二级结构介导的，而家蚕和蜜蜂的Kv2基因编辑需要除exon2以外的片段辅助形成二级结构介导。同时，利用生物信息学手段重新预测出了家蚕和蜜蜂ECS序列(编辑互补序列)。

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致谢

第一章 引言

1.1 C至U RNA编辑

1.1.1高等植物中的RNA编辑

1.1.2哺乳动物载脂蛋白RNA的编辑

1.2 A至I RNA编辑

1.2.1 A至I RNA编辑酶

1.2.2底物与位点编辑特异性

1.2.3非编码区的A至I RNA编辑

1.4 A-I RNA编辑与RNA干扰

1.5 RNA编辑与人类疾病

1.5.1癫痫

1.5.2抑郁症和精神分裂

1.5.3病毒侵染

1.5.4肿瘤

第二章Kv2基因研究进展

2.1钾离子通道分布与组成

2.2 Kv家族种类及结构

2.3 Kv2离子通道

2.4 Kv2基因的RNA编辑

第三章实验方案及设计

3.1 研究目的和意义

3.2 研究内容

3.2.1 Kv2基因A-I RNA编辑位点的检测及分析

3.2.2昆虫Kv2基因A-I RNA编辑机理研究

3.3 技术路线

第四章Kv2基因RNA编辑位点的鉴定与分析

4.1 材料与试剂

4.2实验方法

4.2.1引物设计

4.2.2基因组DNA的提取

4.2.3使用Qiagen RNeasy mini-Kit从昆虫组织中提取总RNA：

4.2.4使用Invitrogen SuperScriptⅢ 1st Strand cDNA Synthesis System进行RT-PCR进行逆转录反应：

4.2.5分别以gDNA和cDNA为模板进行PCR扩增

4.2.6 PCR产物的纯化

4.2.7 PCR产物的胶回收

4.2.8 PCR产物直接测序(由上海英骏生物技术公司完成)

4.2.9 PCR扩增产物的T载体连接反应

4.2.10 E.coli TG1感受态细胞的制备

4.2.11连接产物转化感受态细胞

4.2.12使用AxyGEN Plasmid Miniprep Kit抽提质粒DNA

4.2.13重组质粒酶切鉴定

4.3 结果与分析

4.3.1所研究物种系统进化树的构建

4.3.2各物种基因组与RT-PCR的扩增与序列分析

4.3.3各辑位点编辑效率的分析

4.4 讨论

第五章编辑系统的建立及体内编辑的检测

5.1 材料与试剂

5.2实验方法

5.2.1引物设计

5.2.2细胞培养

5.2.3转染载体的构建

5.2.4共转染果蝇S2细胞

5.2.5编辑系统中的RNA回收

5.2.6 RT-PCR检测编辑情况：

5.3结果与分析

5.3.1二级结构的预测

5.3.2编辑系统的建立

5.3.3体内编辑

5.4 讨论

参考文献

个人简历