抗菌肽Protegrin-1、PR-39在大肠杆菌和紫花苜蓿中串联表达的研究

摘要

PR-39与Protegrin-1(PG-1)都是猪源抗菌肽。PR-39具有广谱的抗细菌、真菌作用；能诱导嗜中性粒细胞的定向迁移,促进伤口恢复,减缓病理损伤,并且具有抗癌作用。PG-1具有很强的抗细菌活性和中等程度的抗真菌作用,还具有快速杀菌的活性；能够抵抗有囊膜的病毒,具有不同程度的抗HIV病毒的活性。本研究利用了大肠杆菌和紫花苜蓿作为生物反应器,串联表达PR-39与PG-1。
　　 1.抗菌肽Protegrin-1、PR-39基因在大肠杆菌中的融合表达为了使猪源抗菌肽Protegrin-1(PG-1)、PR-39在原核表达载体中获得表达,在不改变抗菌肽氨基酸顺序的基础上,根据大肠杆菌偏爱密码子表,替换部分密码子,通过重叠PCR化学合成PG-1、PR-39成熟肽基因片段,重组至融合表达载体pGEX-4T-1中,分别构建融合表达载体pGEX-PG-1、pGEX-PR-39,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,筛选得到的阳性克隆用IPTG进行诱导。SDS-PAGE电泳和Western-blotting检测表明融合蛋白已经成功表达。纯化得到的融合蛋白用肠激酶切割后,经亲合层析得到目的蛋白。重组抗菌肽PG-1和PR-39分别为1.38mg/L、1.11mg/l。抑菌实验结果表明重组抗菌肽具有生物活性。
　　 2.抗菌肽PR-39和Protegrin-1基因在大肠杆菌中的串联表达为了在大肠杆菌中串联表达抗菌肽PR-39和PG-1,设计了四条短核苷酸链,重叠PCR技术扩增得到PK-39和PG-1的串联基因。PR-39和PG-1的基因之间由盐酸羟胺切割位点(Asn-Gly)连接。串联基因片段插入到融合表达载体pGEX-4T-1中,构建融合表达载体pGEX-PR39-PG1,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,阳性克隆用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE电泳分析和Western-blotting检测表明串联基因已经成功表达。融合蛋白GST-PR39-PG1先经盐酸羟胺切割释放出重组抗菌肽PG-1,再经肠激酶切割得到重组抗菌肽PR-39。两种抗菌肽的产量分别为1.5mg/l、1.9mg/1。重组抗菌肽经抑菌试验,表现出生物活性,且抗菌肽PR-39与PG-1混合的抑菌活性强于PR-39与PG-1单个的抑菌活性。
　　 3.抗菌肽Protegrin-1和PR-39基因在紫花苜蓿中的串联表达为了在紫花苜蓿中实现抗菌肽PR-39和PG-1的共表达,用大豆多聚半乳糖醛酸内切酶抑制蛋白(Endopolvgalacturonase-inhibiting protein,PGIP)引导肽作为信号肽,用在植物体内可被特异性切割的短肽作为连接肽,通过化学合成PR-39和PG-1的串联基因。串联基因片段插入到本实验室前期构建好的植物表达载体pC-1301-PMI中,同时构建包含单个抗菌肽的植物表达载体,导入农杆菌对紫花苜蓿遗传转化。由于紫花苜蓿的遗传转化周期长效率低,实验只获得T0代转PR-39和PG-1串联基因紫花苜蓿2株,转PR-39基因的紫花苜蓿4株,转PG-1基因的紫花苜蓿5株。转基因植株经研磨体外抑菌试验表明表达的抗菌肽具有抑菌活性。